ChIP-seq等揭示人畜共患寄生蟲(chóng)弓形蟲(chóng)的蛋白質(zhì)乳酸化和代謝調(diào)控機(jī)制

弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）是弓形蟲(chóng)�。╰oxoplasmosis）廣泛傳播的寄生蟲(chóng)病的病原體之一，但其生物學(xué)特性仍然知之甚少。乳酸（Lactate）作為葡萄糖代謝的產(chǎn)物，不僅在包括弓形蟲(chóng)在內(nèi)的多種生物體中作為能量來(lái)源，還是一種參與基因激活和蛋白質(zhì)功能的調(diào)控分子。賴氨酸乳酸化（Lysine lactylation, Kla）是一種與染色質(zhì)重塑相關(guān)的翻譯后修飾（Posttranslational modifications，PTM），然而在弓形蟲(chóng)中，組蛋白和非組蛋白的Kla尚未被研究。

2022年10月7日，沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院尹德琦博士等為第一作者、沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)陳啟軍教授為通訊作者以“Protein Lactylation and Metabolic Regulation of the Zoonotic Parasite Toxoplasma gondii ”為題在《Genomics, Proteomics & Bioinformatics》雜志發(fā)表研究論文，文章通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）等實(shí)驗(yàn)首次對(duì)弓形蟲(chóng)乳酸進(jìn)行了全面分析，并對(duì)Kla的調(diào)控潛力進(jìn)行了深入剖析，為闡明弓形蟲(chóng)生物學(xué)特性和尋找新的殺蟲(chóng)靶標(biāo)開(kāi)辟了新的途徑。
 

標(biāo)題：Protein Lactylation and Metabolic Regulation of the Zoonotic Parasite Toxoplasma gondii（人畜共患寄生蟲(chóng)弓形蟲(chóng)的蛋白質(zhì)乳酸化和代謝調(diào)控）

時(shí)間：2022-10-7

期刊：Genomics, Proteomics & Bioinformatics

影響因子：IF 9.5

技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq等

研究摘要：
為分析乳酸化在弓形蟲(chóng)寄生蟲(chóng)中的發(fā)生率和功能，研究人員繪制了速殖子增殖細(xì)胞的乳酸化組圖譜，并在弓形蟲(chóng)RH株系中955種蛋白質(zhì)上鑒定出1964個(gè)乳酸化位點(diǎn)。乳酸化蛋白質(zhì)分布在多個(gè)亞細(xì)胞區(qū)域，并與多種生物過(guò)程密切相關(guān)，包括mRNA剪接、糖酵解、氨酰基-tRNA生物合成、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)以及許多信號(hào)通路。研究人員還使用特異性乳酸化抗體進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）分析，分析結(jié)果表明組蛋白H4K12la和H3K14la在基于微管運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞侵襲相關(guān)的弓形蟲(chóng)啟動(dòng)子和外顯子區(qū)域富集。進(jìn)一步驗(yàn)證了組蛋白去乙�；�酶TgHDACs 2、3和4的去乳酸化活性。同時(shí)，研究還表明使用抗組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（TgMYST-A）抗體處理顯著降低了弓形體中的蛋白質(zhì)乳酸化。本研究提供了首個(gè)全球乳酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集，并為進(jìn)一步解析弓形蟲(chóng)的功能生物學(xué)提供了基礎(chǔ)。

研究結(jié)果

（1）弓形蟲(chóng)RH蛋白質(zhì)組中Kla的鑒定

圖1：western blotting、免疫熒光分析（IFA）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析揭示弓形蟲(chóng)中廣泛存在乳酸化。

1. 用抗乳糜蛋白酶抗體（anti-lactyllysine antibody）對(duì)速殖子裂解物（20μg）的SDS-PAGE和western blotting分析。
2. 弓形蟲(chóng)RH速殖子與抗乳糜蛋白酶抗體的IFA分析（綠色）。陰性對(duì)照抗體是正常的兔IgG。細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）染色。
3. 使用抗乳糜蛋白酶抗體的弓形蟲(chóng)ME49的速殖子IFA分析（綠色）。陰性對(duì)照抗體是正常的兔IgG。細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）染色。
4. 賴氨酸乳酸化的LC-MS/MS數(shù)據(jù)。
5. 維恩圖顯示了從三次重復(fù)中獲得的乳酸化蛋白質(zhì)重疊部分。
6. 維恩圖顯示了從三次重復(fù)中獲得的乳酸化位點(diǎn)重疊部分。Kla，賴氨酸乳酸化；LC-MS/MS，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；IFA，免疫熒光分析；T.gondii，弓形蟲(chóng)；SDS-PAGE，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；IgG，免疫球蛋白G；DAPI，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚。

（2）乳酸化蛋白廣泛分布于弓形蟲(chóng)的多個(gè)亞細(xì)胞區(qū)室中

圖2：乳酸化蛋白分布在多個(gè)亞細(xì)胞區(qū)室中，并參與多種生物功能。

1. 已鑒定的乳酸化蛋白的亞細(xì)胞分布。
2. 乳酸化蛋白的KEGG富集分析（Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05）。
3. 使用KOG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行乳酸化蛋白的功能分類。橫軸表示KOG類別，縱軸表示蛋白數(shù)量。

使D. 用Motif-x生成由靶向賴氨酸殘基周圍的20個(gè)殘基組成的乳酸化位點(diǎn)的概率序列motif。每個(gè)字母的大小對(duì)應(yīng)于該氨基酸殘基出現(xiàn)在該位點(diǎn)的頻率。

E. 熱圖顯示乳酸化賴氨酸周圍氨基酸出現(xiàn)的高（紅色）或低（綠色）頻率。紅框表示在修飾位點(diǎn)附近出現(xiàn)頻率更高的氨基酸，綠框表示修飾位點(diǎn)附近的氨基酸頻率較低。KEGG，京都基因和基因組百科全書(shū)；DC，差分；KOG，真核生物同源基因組。

（3）組蛋白乳酸化在弓形蟲(chóng)中得到深刻鑒定

圖3：多個(gè)PTM發(fā)生在相同的組蛋白位點(diǎn)。

這些數(shù)字表示組蛋白上修飾位點(diǎn)的具體位置。不同顏色的橢圓表示不同類型的PTM。不同顏色的框表示不同的域。水平淺藍(lán)色線描述了介導(dǎo)PPI或生物過(guò)程的區(qū)域（氨基酸）的特征（來(lái)自通用蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)的特定信息)。PTM，蛋白翻譯修飾；PPI，蛋白-蛋白互作。
 

圖4：弓形蟲(chóng)H4K12和H3K14被鑒定為組蛋白乳酸化位點(diǎn)。

1. 組蛋白H4K12la和H3K14la的western blotting分析。
2. 組蛋白H4K12la和H3K14la在寄生蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外階段的間接IFA分析。兔IgG作為陰性對(duì)照。

C-D. 弓形蟲(chóng)的組蛋白H4K12la和H3K14la的MS/MS譜。a和b離子是指肽的N-末端部分，y離子是指多肽的C-末端部分。

E. 組蛋白乳酸化位點(diǎn)（H4K12la和H3K14la）在染色體上的結(jié)合區(qū)分布circos圖。最外圈顯示染色體，內(nèi)圈顯示每個(gè)樣本的分布趨勢(shì)。數(shù)據(jù)代表三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

F. H4K12la和H3K14la peaks在全基因組中的重疊分布。圈條長(zhǎng)度表示富集程度，圓圈內(nèi)的位置對(duì)應(yīng)于peaks位置。ChIP-seq，染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序。

（4）磷酸果糖激酶II（PFKII）是乳酸化的重要調(diào)控因子

圖5：抗TgPFKII抗體降低了蛋白質(zhì)乳酸化。

1. 通過(guò)western blotting驗(yàn)證純化的重組蛋白TgPFKII。
2. 弓形蟲(chóng)RH和ME49中TgPFKII表達(dá)水平（131kDa）的western blotting分析。β-肌動(dòng)蛋白用于歸一化。數(shù)據(jù)以三個(gè)生物重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（*，P<0.05；**，P<0.01；Student t檢驗(yàn)）。
3. 用抗PFKII抗體免疫沉淀源自弓形蟲(chóng)RH和ME49的可溶性蛋白，并用抗PFKII抗體檢測(cè)沉淀的PFKII蛋白（箭頭指示）。
4. 通過(guò)IFA分析不同濃度的陰性IgG（小鼠IgG）對(duì)蛋白質(zhì)乳酸化（綠色）沒(méi)有影響。
5. 抗TgPFKII抗體以濃度依賴性方式抑制蛋白質(zhì)乳酸化（綠色）。
6. 分別對(duì)用抗PFKII抗體和陰性對(duì)照抗體處理的組進(jìn)行免疫熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析。采用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析。所有數(shù)據(jù)均顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（N>10）。***，與對(duì)照組相比P＜0.001。
7. western blotting檢測(cè)不同濃度的抗PFKII抗體對(duì)弓形蟲(chóng)RH乳酸化水平的影響。β-肌動(dòng)蛋白用于歸一化。IP，免疫沉淀；PFKII，磷酸果糖激酶。

（5）組蛋白去乙�；�酶（HDAC）和乙酰轉(zhuǎn)移酶抗體對(duì)其酶活性產(chǎn)生顯著影響

圖6：與蛋白質(zhì)乳酸化相關(guān)的TgHDAC2、TgHDAC3、TgHDLC4和TgMYST-A的功能初步分析。

1. TgHDAC2、TgHDAC3、TgHDLC4和TgMYST-A的序列特征。
2. 特異性抗體對(duì)TgHDAC2（71 kDa）、TgHDAC3（53 kDa）、TgHDAC4（101 kDa）和TgMYST-A（56 kDa）的表達(dá)進(jìn)行western blotting分析。
3. TgHDAC2、TgHDAC3、TgHDAC4和TgMYST-A的間接IFA分析（共定位）。
4. 特異性抗體對(duì)PTM影響的流程圖。
5. 抗TgHDAC2、抗TgHDLAC3、抗Tg HDAC4和抗TgMYST-A抗體對(duì)弓形蟲(chóng)的乳酸化、2-羥基異丁酰化、巴豆�；�和乙�；�的調(diào)控。用箭頭指示修飾水平變化的蛋白。β-肌動(dòng)蛋白用于歸一化。

HDAC2、HADC3和HDAC4是組蛋白去乙�；�酶；MYST-A是一種組蛋白賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。

研究小結(jié)
研究總結(jié)了TF相關(guān)蛋白、RNA聚合酶相關(guān)蛋白、DBP和RBP中的乳酸化蛋白，發(fā)現(xiàn)它們與一系列過(guò)程有關(guān)，包括基因轉(zhuǎn)錄、RNA剪接、蛋白質(zhì)翻譯和加工（圖7）。在弓形蟲(chóng)中總共鑒定出23個(gè)TF、7個(gè)RNA聚合酶、6個(gè)DBP和27個(gè)RBP，分別具有49、8、8和62個(gè)Kla位點(diǎn)。

總之，本研究建立了第一個(gè)人畜共患寄生蟲(chóng)弓形蟲(chóng)蛋白質(zhì)乳酸化的綜合圖譜，并揭示了乳酸化在寄生蟲(chóng)的各種生物過(guò)程中深刻調(diào)控與能量代謝和基因激活相關(guān)的蛋白質(zhì)。這些數(shù)據(jù)為開(kāi)發(fā)抗寄生蟲(chóng)藥物提供了新的途徑。

圖7：乳酸化參與基因調(diào)控示意圖。

示意圖顯示乳酸化蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子蛋白、RNA聚合酶相關(guān)蛋白、DBP和RBP，參與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控過(guò)程。藍(lán)框內(nèi)的字體表明，乳酸化RBPs可能在不同細(xì)胞的各種轉(zhuǎn)錄后過(guò)程中發(fā)揮廣泛作用。在細(xì)胞核中將前體mRNA剪接成成熟mRNA的過(guò)程中，乳酸化的RBPs和剪接因子是主要的參與者。此外，乳酸化的RBPs可以幫助mRNA在核糖體中翻譯成蛋白質(zhì)，一些RBPs可能被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。DBP，DNA結(jié)合蛋白；UPS，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)；RBP、RNA結(jié)合蛋白。

參考文獻(xiàn)：
Yin D, Jiang N, Cheng C, Sang X, Feng Y, Chen R, Chen Q. Protein Lactylation and Metabolic Regulation of the Zoonotic Parasite Toxoplasma gondii. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2022 Oct 7. pii: S1672-0229(22)00126-7. doi: 10.1016/j.gpb.2022.09.010. PubMed PMID: 36216028.