妊娠中期小鼠神經(jīng)發(fā)育的空間全轉(zhuǎn)錄組特征分析

哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在空間和時(shí)間上受基因表達(dá)的精確調(diào)控。對(duì)驅(qū)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組研究，傳統(tǒng)方法主要采用低靶標(biāo)數(shù)的原位技術(shù)或者對(duì)離體胚胎進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，但隨著空間多組學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展和成熟應(yīng)用，目前研究人員可以實(shí)現(xiàn)在保留組織空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對(duì)組織切片中任何感興趣的區(qū)域（ROI）進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組（～2萬(wàn)個(gè)基因）或者蛋白質(zhì)組（570多種蛋白質(zhì)）的檢測(cè)和探究。

在2023美國(guó)神經(jīng)學(xué)年會(huì)（SfN）上展示的一項(xiàng)研究中，研究人員利用GeoMx®空間多組學(xué)技術(shù)對(duì)健康C57BL/6小鼠胚胎E9-E15四個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）和腸道神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）的特定解剖學(xué)組織亞結(jié)構(gòu)進(jìn)行了形態(tài)表征和全轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)分析。研究人員觀察到不同空間位置的組織區(qū)域具有特異性的表達(dá)譜特征。這些結(jié)果為發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸道神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的基因表達(dá)提供了豐富的時(shí)空?qǐng)D譜，為神經(jīng)疾病尤其是神經(jīng)發(fā)育障礙研究提供了重要參考。
 

研究摘要

研究人員利用GeoMx® DSP對(duì)重點(diǎn)關(guān)注的神經(jīng)組織區(qū)域中的75個(gè)感興趣區(qū)域（ROI）進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組的檢測(cè)分析。使用開源的GeomxTools R軟件包進(jìn)行了LMM差異表達(dá)檢測(cè)和相關(guān)性分析。

樣本組織：分別處于E9、E11、E13和E15期的四只健康C57BL/6小鼠胚胎的新鮮冷凍矢狀組織切片（5µm厚），共17個(gè)組織樣本。

檢測(cè)方法：GeoMx小鼠空間全轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)方案（GeoMx® Mouse WTA）：包含~20,000個(gè)蛋白編碼基因。

組織形態(tài)學(xué)標(biāo)記：熒光標(biāo)記的β3微管蛋白和p63蛋白來(lái)分別標(biāo)記神經(jīng)元和上皮細(xì)胞。

 

GeoMx® DSP工作流程

定量試劑：針對(duì)每個(gè)靶標(biāo)RNA都設(shè)計(jì)了特異性探針，探針序列包括與靶標(biāo)RNA特異性結(jié)合的捕獲序列；與靶標(biāo)RNA一一對(duì)應(yīng)的獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)條碼；以及將這兩段偶聯(lián)在一起的光可裂解的鏈接子。

成像試劑：熒光標(biāo)記的抗體或RNA，用于展示組織的形態(tài)學(xué)特征，標(biāo)記組織中特定的細(xì)胞類型或組織區(qū)域。

GeoMx采用了和標(biāo)準(zhǔn)免疫組化或原位雜交方法類似的樣本處理流程。具體將成像試劑（帶有熒光的形態(tài)學(xué)標(biāo)記）、定量試劑（所有靶標(biāo)的特異性探針）與組織切片進(jìn)行共雜交。根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)記所展現(xiàn)出的組織結(jié)構(gòu)可以指導(dǎo)ROI的圈選。GeoMx® DSP儀器內(nèi)置的百萬(wàn)級(jí)微鏡陣列可以被數(shù)字化調(diào)控形成特定的反射面，進(jìn)而將自下而上發(fā)射的紫外光反射為契合每個(gè)ROI形狀的紫外光束，精準(zhǔn)地照射至該ROI區(qū)域，使得該區(qū)域中所結(jié)合的定量探針中的光可裂解鏈接子斷裂，其后端偶聯(lián)的分子標(biāo)識(shí)條碼得以釋放，并及時(shí)地被上端極細(xì)的微針吸取收集至收集板特定的孔中。當(dāng)所有的ROI照射和收集完畢后，進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序獲取每個(gè)靶標(biāo)的表達(dá)量。

從新鮮冷凍固定組織圈選感興趣區(qū)域（ROI）

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，研究人員在前腦的三個(gè)矢狀切面上選取了25個(gè)ROI，并確定了E9發(fā)育期在端腦和間腦區(qū)域中表現(xiàn)出顯著差異表達(dá)的83個(gè)基因。這些基因中包含對(duì)神經(jīng)元命運(yùn)決定至關(guān)重要的形態(tài)發(fā)生因子。

與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相比，腸道神經(jīng)系統(tǒng)的研究相對(duì)較少，因此研究人員在6個(gè)矢狀切面腸道神經(jīng)元層上額外選擇了20多個(gè)組織區(qū)域（ROI），進(jìn)行了進(jìn)一步分析。研究人員觀察到，不同ROI中廣泛的轉(zhuǎn)錄差異取決于它們?cè)谀c道中的位置，也就是說(shuō)腸道中不同空間位置的組織區(qū)域具有特異性的表達(dá)特征。

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組織切片示例。彩色幾何圖形表示所分析的感興趣區(qū)域（ROI），一種顏色表示一個(gè)獨(dú)特的ROI。從17種組織中對(duì)圈選的733個(gè)感興趣區(qū)（ROI）進(jìn)行分析：軀體、大腦、十二指腸、食道、前腸、心臟、腎臟、肢芽、肺、中腸、神經(jīng)管、胰腺、咽部、胎盤、皮膚、胃和氣管。其中75個(gè)腦、神經(jīng)管和腸ROI主要是神經(jīng)細(xì)胞或部分神經(jīng)細(xì)胞。

ROI大小范圍從1,400到180,000 µm2不等，平均每個(gè)ROI包含288個(gè)細(xì)胞。神經(jīng)ROI范圍從4,000到110,000 µm2不等，平均每個(gè)ROI包含472個(gè)細(xì)胞。
 

神經(jīng)元基因表達(dá)

對(duì)精選的1,000個(gè)重點(diǎn)關(guān)注基因在75個(gè)ROI中的表達(dá)分析

 

發(fā)育中端腦和間腦的轉(zhuǎn)錄差異

E9階段間腦（MES，n=8 ROIs）和端腦（TEL，n=10 ROIs）之間的基因表達(dá)差異。

與神經(jīng)元發(fā)育和分化有關(guān)的基因

 

腸道神經(jīng)系統(tǒng)及其周圍細(xì)胞的基因表達(dá)

顯示了E13階段腸道中涉及神經(jīng)元分化的四個(gè)基因的空間分布。每個(gè)ROI均以歸一化基因表達(dá)量進(jìn)行著色，箭頭指向神經(jīng)元豐富的最外層 ROI。中腸ROI顯示在每張圖像的左上部分，胃ROI顯示在每張圖像的右下部分。

 

小結(jié)

GeoMx® DSP可對(duì)小鼠胚胎多個(gè)發(fā)育時(shí)期的多個(gè)組織中700多個(gè)感興趣區(qū)域進(jìn)行分析；

與胚胎神經(jīng)元發(fā)育和分化有關(guān)的部分基因在E9期端腦和間腦區(qū)域之間出現(xiàn)差異表達(dá)；

通過(guò)分析整個(gè)轉(zhuǎn)錄組，還得到了一些意想不到的新發(fā)現(xiàn)，比如發(fā)現(xiàn)Irx5等基因在不同腦區(qū)之間有不同的表達(dá)。該基因已知有助于產(chǎn)后神經(jīng)發(fā)生，但在胚胎腦發(fā)育過(guò)程中卻未被描述過(guò)；

在ENS神經(jīng)元和鄰近細(xì)胞中，觀察到各組織之間存在廣泛的轉(zhuǎn)錄差異，這些組織共同構(gòu)成了腸道。

 

GeoMx® DSP 空間多組學(xué)分析系統(tǒng)

GeoMx® Digital Spatial Profiler（DSP）空間多組學(xué)平臺(tái)結(jié)合了組織影像分析和原位定量技術(shù)，可在展示全局組織結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)從復(fù)雜組織中對(duì)細(xì)胞亞群或特定結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)分析。在獲得高分辨率的樣本空間信息的同時(shí)實(shí)現(xiàn)高靶標(biāo)蛋白（>570種蛋白質(zhì)）和全轉(zhuǎn)錄組（~20000個(gè)基因）空間原位表達(dá)譜的精準(zhǔn)獲取。最新的DSP工作流程可以支持在一張組織切片上同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)和RNA的空間原位表達(dá)信息。GeoMx® DSP兼容多種組織樣本類型（如FFPE、新鮮凍存樣本等），成為基礎(chǔ)科研、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究和臨床實(shí)踐探究中強(qiáng)大有力的工具，使不同領(lǐng)域（如腫瘤學(xué)、免疫疾病、神經(jīng)科學(xué)、藥物研發(fā)等）的研究人員能夠深入洞察組織微環(huán)境、功能亞結(jié)構(gòu)、免疫系統(tǒng)作用機(jī)制和生物標(biāo)志物發(fā)掘，滿足不同階段的研究和應(yīng)用需求！