蛋白定量測(cè)定的常見方法及優(yōu)缺點(diǎn)

蛋白定量測(cè)定是實(shí)驗(yàn)生物學(xué)中一種常用的技術(shù)，用于測(cè)量樣品中蛋白質(zhì)的濃度或總量。這種測(cè)定對(duì)于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域非常重要。

圖1. 定量蛋白組分析

一、蛋白定量的基本流程包括：

 

樣品制備：細(xì)胞提取物、組織樣品、血清、血漿、尿液或其他包含蛋白質(zhì)的生物樣品。確保樣品是干凈的，沒有雜質(zhì)。
選擇測(cè)定方法：選擇適合你的實(shí)驗(yàn)需求的蛋白定量方法。
制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：制備一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，需要標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
測(cè)定樣品：將樣品與測(cè)定方法中的試劑混合，按照方法要求的步驟進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色、吸光度或其他特性，使用分光光度計(jì)或其他相關(guān)儀器測(cè)量并記錄結(jié)果。
計(jì)算蛋白質(zhì)濃度：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或測(cè)定方法的公式，計(jì)算出樣品中的蛋白質(zhì)濃度。

二、蛋白定量的常見方法包括：

1、Bradford 蛋白質(zhì)測(cè)定法：

 

原理：這種方法基于柯馬斯亮藍(lán)G-250染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)所發(fā)生的顏色變化。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，靈敏度較高。
缺點(diǎn)：受到洗滌劑和其他化學(xué)物質(zhì)的干擾。

2、Lowry 法：

 

原理：基于銅離子在堿性條件下與蛋白質(zhì)中的多肽鍵結(jié)合，并進(jìn)一步與Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化。
優(yōu)點(diǎn)：適用于較低濃度的蛋白質(zhì)。
缺點(diǎn)：步驟比Bradford法更復(fù)雜，且易受其他物質(zhì)的干擾。

3、BCA法（雙縮脲酸法）：

 

原理：與Lowry 法類似，但使用BCA試劑，對(duì)銅離子和蛋白質(zhì)反應(yīng)更為敏感。
優(yōu)點(diǎn)：適用于微量蛋白質(zhì)的測(cè)定，穩(wěn)定性好。
缺點(diǎn)：需要較長(zhǎng)的孵育時(shí)間。

4、紫外吸收光譜法：

 

原理：蛋白質(zhì)中的色氨酸和酪氨酸在紫外光下有特定的吸收峰。
優(yōu)點(diǎn)：快速且不需要添加任何試劑。
缺點(diǎn)：對(duì)其他物質(zhì)的吸收干擾敏感，需要較純凈的樣品。

5、基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白定量

 

1）無(wú)標(biāo)記定量

 

原理：不使用化學(xué)標(biāo)簽，直接通過分析肽段離子的強(qiáng)度或計(jì)數(shù)來定量蛋白質(zhì)。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)化，適用于廣泛的樣品類型，無(wú)需額外的化學(xué)修飾。
缺點(diǎn)：對(duì)樣品制備和質(zhì)譜操作的質(zhì)量要求高，數(shù)據(jù)處理和解釋較為復(fù)雜。

2）iTRAQ/TMT

 

原理：使用特殊的化學(xué)標(biāo)簽對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。在質(zhì)譜中，標(biāo)記產(chǎn)生特定的裂解離子，用于定量分析。
優(yōu)點(diǎn)：可以同時(shí)分析多個(gè)樣本，提高了實(shí)驗(yàn)的吞吐量。
缺點(diǎn)：高成本，數(shù)據(jù)處理復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和執(zhí)行有較高要求。

3）同位素編碼親和標(biāo)記（ICAT）

 

原理：使用含有不同同位素的化學(xué)標(biāo)簽對(duì)蛋白質(zhì)或肽段進(jìn)行標(biāo)記，然后利用質(zhì)譜分析比較不同樣本中蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度。
優(yōu)點(diǎn)：提供了準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)相對(duì)量比較，可用于復(fù)雜樣品。
缺點(diǎn)：成本較高，操作復(fù)雜，可能無(wú)法檢測(cè)未標(biāo)記的蛋白質(zhì)。

4）SWATH-MS

 

原理：基于數(shù)據(jù)獨(dú)立采集，通過系統(tǒng)地掃描所有預(yù)定質(zhì)量窗口來收集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
優(yōu)點(diǎn)：提供高通量、高重復(fù)性的定量信息，適合復(fù)雜樣品分析。
缺點(diǎn)：需要高級(jí)的數(shù)據(jù)處理技術(shù)，對(duì)儀器性能要求高。

5）多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）

 

原理：選擇特定的前體離子和產(chǎn)物離子對(duì)，用于定量特定肽段或蛋白質(zhì)。
優(yōu)點(diǎn)：高度特異性，靈敏度高，適合低豐度目標(biāo)蛋白的定量。
缺點(diǎn)：每次只能定量有限數(shù)量的目標(biāo)蛋白，需要事先知道目標(biāo)蛋白的信息。