自噬通過骨膜蛋白/β-連環(huán)蛋白軸在壓縮下介導(dǎo)成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化

牙骨質(zhì)是覆蓋于牙根表面的薄層礦化組織，擔(dān)負(fù)著連接牙齒與牙周韌帶（PDL）的作用。然而，在機(jī)械力作用下，牙骨質(zhì)常發(fā)生損傷，導(dǎo)致牙根外吸收和牙周組織功能障礙。成牙骨質(zhì)細(xì)胞（Cementoblasts）分泌礦化物質(zhì)形成牙骨質(zhì)組織，因此負(fù)責(zé)修復(fù)牙骨質(zhì)和恢復(fù)牙周功能。成牙骨質(zhì)細(xì)胞的功能受壓縮力調(diào)節(jié)，但壓縮力對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化的影響仍存在爭(zhēng)議。

自噬（Autophagy），即細(xì)胞“吃掉自己”的過程，是一種細(xì)胞自我降解和循環(huán)利用胞內(nèi)組分的過程。研究證實(shí)，自噬囊泡負(fù)責(zé)將礦化物質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外基質(zhì)（ECM），突出了自噬在礦化組織重塑中的作用。然而，自噬對(duì)壓縮下成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化的影響尚不清楚，調(diào)控自噬介導(dǎo)的成牙骨質(zhì)細(xì)胞變化的下游機(jī)制也需要進(jìn)一步探索。

礦化相關(guān)的信號(hào)通路，包括轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、Wnt 和 Hippo 通路，作為牙根吸收的治療靶點(diǎn)引起了人們的興趣。越來越多的證據(jù)表明，自噬調(diào)節(jié)許多信號(hào)通路，包括TGF-β、Wnt和PI3K信號(hào)。自噬和礦化相關(guān)通路之間的合作仍然知之甚少。鑒定自噬介導(dǎo)的分子或信號(hào)通路可以為成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化開發(fā)新策略。

在北京大學(xué)口腔醫(yī)院口腔正畸科、國家口腔醫(yī)學(xué)中心課題團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，闡明了壓縮力對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化和自噬的影響。該研究在體外和體內(nèi)測(cè)定了自噬在壓縮下成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化中的作用，然后探討了自噬作用對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化作用的下游機(jī)制，分析了自噬抑制劑處理的成牙骨質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)，以鑒定參與成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化的分子和信號(hào)通路。這些發(fā)現(xiàn)拓寬了對(duì)壓縮力下成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化背后的細(xì)胞和分子事件的理解，并將有助于開發(fā)修復(fù)牙根吸收和牙周功能障礙的新治療靶點(diǎn)。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在Journal of Cellular Physiology 期刊題為“Autophagy mediates cementoblast mineralization under compression through periostin/β-catenin axis”。

首先，將成牙骨質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行壓縮力負(fù)荷（1.5 g/cm²）12小時(shí)，隨后在增殖培養(yǎng)基（PM）或礦化培養(yǎng)基（MM）中孵育，發(fā)現(xiàn)壓縮力抑制了 PM 和 MM 組中與成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化相關(guān)的骨鈣素（OCN）和osterix（OSX）的mRNA的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡分析和ALP染色顯示，在壓縮載荷下，成牙骨質(zhì)細(xì)胞的礦化能力降低。

為了評(píng)估體內(nèi)正畸力下成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化的變化，建立了小鼠牙根吸收模型，發(fā)現(xiàn)隨著機(jī)械力加載時(shí)間的增加，牙齒移動(dòng)距離逐漸增加，并且在施加力3周后，在遠(yuǎn)端頰根受壓側(cè)出現(xiàn)明顯的吸收腔隙。IHC顯示，礦化相關(guān)蛋白OCN在受壓側(cè)的成牙骨質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)降低。

為了評(píng)估壓縮力對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞自噬的影響，檢測(cè)了自噬的兩個(gè)標(biāo)志物，即自噬受體 P62 的表達(dá)和 LC3-I 向 LC3-II 的轉(zhuǎn)化。蛋白質(zhì)印跡分析表明，壓縮力增加了成牙骨質(zhì)細(xì)胞中P62的表達(dá)，但降低了LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化（圖1 a、b）。此外，在受壓縮力刺激的細(xì)胞中，自噬體陽性LC3的形成顯著減少（圖1 c、d），這表明壓縮力抑制了成牙骨質(zhì)細(xì)胞的自噬活性，且壓縮力導(dǎo)致成牙骨質(zhì)細(xì)胞受壓側(cè) LC3 顯著下調(diào)（圖1 e、f）。位于牙根表面的Cap+ 細(xì)胞上的LC3染色證實(shí)，在壓縮力作用下，LC3+ 成牙骨質(zhì)細(xì)胞較少（圖1 g、h）。

圖1 在壓縮力下，自噬在成牙骨質(zhì)細(xì)胞中受到抑制。

接下來，為了確定自噬在成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化中的作用，檢測(cè)了礦化誘導(dǎo)對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，P62的表達(dá)減少，而LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化增加。然后用自噬激活劑Rapa處理成牙骨質(zhì)細(xì)胞以增強(qiáng)自噬或自噬抑制劑CQ抑制自噬。qRT-PCR分析表明，Rapa處理顯著增加了成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化相關(guān)基因的表達(dá)，而CQ處理降低了其表達(dá)。當(dāng)用Rapa處理細(xì)胞時(shí)，成牙骨質(zhì)細(xì)胞的礦化能力增強(qiáng)，而當(dāng)用CQ處理細(xì)胞時(shí)則相反。這說明自噬是成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化所必需的。

然后實(shí)驗(yàn)試圖確定壓縮力是否通過自噬調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化，用Rapa預(yù)處理成牙骨質(zhì)細(xì)胞，然后暴露于壓縮力（圖2 a）。在PM和MM組中，Rapa挽救了壓縮抑制的礦化相關(guān)基因OSX和OCN的表達(dá)（圖2 b）。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，Rapa處理后，OSX和OCN蛋白水平在壓縮力下的下降被逆轉(zhuǎn)（圖2 c、d）。為了進(jìn)一步證實(shí)自噬對(duì)體內(nèi)成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化的影響，將小鼠全身注射Rapa并施加壓縮力3周，結(jié)果顯示，遠(yuǎn)端牙根力誘導(dǎo)的牙根吸收量較低，提示注射Rapa可部分緩解牙根吸收（圖2 e、f）。牙根受壓側(cè)的成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化減少，用Rapa處理后，這種效果被逆轉(zhuǎn)（圖2 g、h）。由于 PDL 附著的質(zhì)量對(duì)于施加力后牙周功能恢復(fù)至關(guān)重要，因此使用 PSR 染色來評(píng)估附著在牙骨質(zhì)上的膠原纖維，發(fā)現(xiàn)牙根面受壓側(cè)PDL附著顯著減少，而這通過Rapa被部分逆轉(zhuǎn)（圖2 i、j）。這說明，壓縮力抑制的成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化部分依賴于自噬。

圖2 自噬恢復(fù)了受壓縮力抑制的成牙骨質(zhì)細(xì)胞的礦化。

進(jìn)一步地，為了確定抑制自噬可抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化的分子機(jī)制，進(jìn)行了高通量RNA-seq 和GO富集分析，以鑒定與成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化相關(guān)的mRNAs。GO結(jié)果表明，4種 mRNAs（Postn、Tnc、Omd、Mgp）顯著下調(diào)，因此可能參與成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化。用自噬抑制劑CQ處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)mRNAs（Postn和Tnc）顯著減少。通過蛋白質(zhì)印跡分析和免疫熒光染色的進(jìn)一步驗(yàn)證確定，在CQ處理的成牙骨質(zhì)細(xì)胞中，Postn的蛋白質(zhì)水平受到顯著抑制，此外，Postn在牙根表面的表達(dá)顯著降低。

然后為了確定 Postn 對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化的影響，用針對(duì) Postn 的 siRNAs（si Postn-1/2）或?qū)φ眨∟C）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。結(jié)果表明，誘導(dǎo) 4 天后，敲低 Postn 顯著降低了 BSP、OSX、OCN 和 COL1 的基因表達(dá)（圖3 a）。BSP、OSX 和 OCN 的蛋白質(zhì)印跡分析以及 BSP 和 OSX 的免疫熒光染色表明，敲低 Postn 后，成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化受到抑制（圖3 b-e）。ALP染色和活性顯示出類似效應(yīng)（圖3 f、g）。這些數(shù)據(jù)表明，敲低Postn在體外抑制了成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化。此外，越來越多的證據(jù)表明，Postn對(duì)自噬具有調(diào)節(jié)作用。因此還研究了Postn對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)隨著Postn的敲低，自噬上調(diào)。

圖3 Postn的敲低抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化。

由于Postn調(diào)節(jié)Wnt配體和Wnt信號(hào)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路β-連環(huán)蛋白，因此實(shí)驗(yàn)最后進(jìn)一步嘗試確定 Postn 在 Wnt/β-catenin 信號(hào)中的作用。結(jié)果表明，Postn 敲低降低了 Wnt 靶基因的 mRNA 水平，而 β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄水平僅受到輕微抑制，且顯著降低了非磷酸化（活性）β-連環(huán)蛋白，并略微降低了總β-連環(huán)蛋白。

為了進(jìn)一步確定Postn是否調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性，用CHX（10μM）檢測(cè)了β-連環(huán)蛋白的半衰期。結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，Postn敲低的成牙骨質(zhì)細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白的半衰期縮短。接下來，用Wnt信號(hào)激動(dòng)劑SKL2001（30μM）處理細(xì)胞顯著增加了對(duì)照細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，而在si Postn細(xì)胞中僅輕微上調(diào)β-連環(huán)蛋白，這表明Postn可能在β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性中發(fā)揮作用。

泛素化是降解β連環(huán)蛋白所必需的。因此，用蛋白酶體抑制劑MG132（5μM）處理成牙骨質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Postn敲低后β-連環(huán)蛋白水平降低，MG132處理后，這種減少被逆轉(zhuǎn)，這表明Postn以蛋白酶體依賴性方式調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白的降解。IP 分析證實(shí)，成牙骨質(zhì)細(xì)胞中的 Postn 敲低顯著增加了 β-連環(huán)蛋白的泛素化。qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析確定，通過激活β-連環(huán)蛋白逆轉(zhuǎn)了敲低Postn后礦化相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的降低。這些數(shù)據(jù)說明，敲低Postn通過促進(jìn)β-連環(huán)蛋白泛素化來調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)。

圖4 自噬在機(jī)械壓縮下介導(dǎo)成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化中的作用。自噬在介導(dǎo)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的礦化中是必不可少的，自噬激活是緩解壓縮力下牙根吸收所必需的。自噬通過 Postn 調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化，Postn 進(jìn)一步調(diào)節(jié) Wnt/β-catenin 信號(hào)，部分通過調(diào)節(jié) β-catenin 的穩(wěn)定性。

總體而言，該研究數(shù)據(jù)提供了證據(jù)，證明自噬對(duì)于恢復(fù)體外和體內(nèi)壓縮力抑制的成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化是必不可少的。研究進(jìn)一步證明了自噬調(diào)節(jié)Postn的表達(dá)，并且Postn通過β-連環(huán)蛋白的泛素化部分調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化。Postn/β-catenin軸的這種新發(fā)現(xiàn)的功能可以解釋自噬如何在壓縮力下介導(dǎo)成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化，還確定了恢復(fù)牙骨質(zhì)礦化和牙周組織再生的新治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Yang Y, Liu H, Wang R, Zhao Y, Zheng Y, Huang Y, Li W. Autophagy mediates cementoblast mineralization under compression through periostin/β-catenin axis. J Cell Physiol. 2023 Sep;238(9):2147-2160. doi: 10.1002/jcp.31075. Epub 2023 Jul 21. PMID: 37475648.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37475648/

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