探秘蛋白質(zhì)從頭測(cè)序技術(shù)的原理與流程

蛋白質(zhì)從頭測(cè)序(De Novo Sequencing)是指不依賴于任何已知蛋白質(zhì)或核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，僅依賴于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，來(lái)確定蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列的技術(shù)。這種技術(shù)在新蛋白質(zhì)或修飾蛋白質(zhì)的鑒定中尤為重要。

一、原理：

從頭測(cè)序通常利用質(zhì)譜技術(shù)（MS）。蛋白質(zhì)或多肽在質(zhì)譜儀中被電離，產(chǎn)生正離子。這些離子在碰撞細(xì)胞中與碰撞氣體（例如氬氣）產(chǎn)生碰撞，使多肽或蛋白質(zhì)分裂成一系列的小片段離子。這些碎片離子的質(zhì)譜被稱為串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）。MS/MS中的碎片離子是由于蛋白質(zhì)或多肽的肽鍵斷裂形成的，所以其質(zhì)量差表示了兩個(gè)相鄰的氨基酸殘基的質(zhì)量。

二、流程：

1.樣品準(zhǔn)備：

提純的蛋白質(zhì)或多肽樣品被準(zhǔn)備好并通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄋ腿胭|(zhì)譜儀中。

2.電離：

使用電噴霧電離(ESI)或激光解吸/電離飛行時(shí)間（MALDI-TOF）技術(shù)，將蛋白質(zhì)或多肽電離成離子。

3.質(zhì)譜分析：

首先通過(guò)質(zhì)譜儀測(cè)量蛋白質(zhì)或多肽的母體離子的m/z值，然后選擇特定的母體離子進(jìn)行進(jìn)一步的碰撞以產(chǎn)生碎片離子。

4.串聯(lián)質(zhì)譜分析：

母體離子在碰撞細(xì)胞中與碰撞氣體產(chǎn)生碰撞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)或多肽分裂并形成一系列的碎片離子。這些碎片離子的m/z值被測(cè)量，并由此得到串聯(lián)質(zhì)譜。

5.數(shù)據(jù)分析：

使用專門的軟件，如Mascot、PEAKS等，對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過(guò)比對(duì)碎片離子之間的質(zhì)量差異來(lái)推斷原始蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列。

6.驗(yàn)證：

通過(guò)其他實(shí)驗(yàn)方法，如Edman降解法或合成對(duì)應(yīng)的多肽進(jìn)行驗(yàn)證。

圖1

蛋白質(zhì)從頭測(cè)序技術(shù)的發(fā)展在很大程度上受益于質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步。隨著儀器靈敏度和分辨率的提高，以及數(shù)據(jù)處理軟件的進(jìn)步，這一技術(shù)在蛋白組學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用將更為廣泛。