CEM MultiPep 合成器應(yīng)用：SPOT 肽合成的質(zhì)量控制

01 什么是SPOT合成？

What is SPOT synthesis?

SPOT 方法由 Ronald Frank 開(kāi)發(fā)，用于在均質(zhì)膜載體上的不同位點(diǎn)同時(shí)合成多肽。該技術(shù)的原理是將預(yù)活化的氨基酸衍生物的小液滴分配到多孔膜上預(yù)定義的位置陣列上。液滴被吸收并形成單獨(dú)的反應(yīng)室，用于固相合成中的化學(xué)反應(yīng)。大量不同的點(diǎn)可以排列在一張膜上，并且這些點(diǎn)中的每一個(gè)都可以通過(guò)相應(yīng)試劑溶液的手動(dòng)或自動(dòng)輸送來(lái)單獨(dú)處理。每個(gè)區(qū)域的點(diǎn)數(shù)和點(diǎn)大小由膜的吸收能力和液滴的體積決定。根據(jù)基質(zhì)的特定功能，點(diǎn)大小與合成的特定規(guī)模相關(guān)。 Ronald Frank 最初使用的濾膜仍然是蕞受歡迎的載體，由改性纖維素濾紙制成。

在 MultiPep 1&2 合成器上合成肽陣列是一種創(chuàng)建大量肽的廉價(jià)且方便的方法。它們通過(guò)活化氨基酸液滴的沉積在纖維素膜支持物上合成。與之前相比，膜和氨基功能之間的鍵合在穩(wěn)定性上得到了改善。它現(xiàn)在對(duì) 100% 三氟乙酉夋穩(wěn)定，并且在堿性條件下進(jìn)行試驗(yàn)不會(huì)導(dǎo)致肽損失。該鍵不能被切割以釋放肽。肽保持共價(jià)連接，因此難以進(jìn)行質(zhì)量控制。有幾種方法可以獲取有關(guān)合成質(zhì)量的信息。

• 生物素，用簡(jiǎn)單的普通鏈霉親和素-報(bào)告基因共軛物檢測(cè)
• 鏈霉親和素報(bào)告共軛物也能檢測(cè)到 N 端的鏈霉標(biāo)簽II(NWSHPQFEK)。
• 羅丹明染料，像氨基酸一樣容易耦合，在日光條件下可見(jiàn)

04 在合成過(guò)程中進(jìn)行一些檢查

Perform some checks during synthesis

手冊(cè)中介紹了在合成過(guò)程中觀察游離氨基的溴酚染色步驟。簡(jiǎn)而言之，在溶液中沒(méi)有堿的情況下用溴酚藍(lán)在 DMF 中的極稀釋溶液（1% 溶液，1:100 稀釋）對(duì)膜進(jìn)行染色。斑點(diǎn)應(yīng)顯示為淡藍(lán)色，其強(qiáng)度隨序列而變化。可將薄膜影印，以詠久記錄一些相關(guān)的合成步驟。您還可以使用手持式紫外燈來(lái)觀察合成后的肽。特別是色氨酸序列在這種紫外燈下會(huì)發(fā)光。這種紫外燈很容易買到而且價(jià)格便宜。通常由礦物學(xué)家使用或用于驗(yàn)鈔。
 

上圖為煙草在 LUYOR-3410 紫外線燈照射下觀察到的效果

05 分析一些參考肽

Analyze some reference peptides

您可以切出單個(gè)斑點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行氨基酸分析。更好、信息量更大的質(zhì)控方法是 MALDI 分析。讓一些肽在 C 端以 Lys-Gly 結(jié)尾。在完荃側(cè)鏈脫保護(hù)后切下斑點(diǎn)，用胰蛋白酶去除肽。這樣得到的溶液中即使只有百分之幾的肽被釋放出來(lái)，也足以進(jìn)行 MALDI分析。請(qǐng)注意，如果存在其他 Lys或 Arg 殘基，肽也會(huì)在內(nèi)部被切斷。如果在第一個(gè)循環(huán)中引入一個(gè)可裂解的連接體(如 Rink 酰胺連接體)，則整個(gè)肽都可以用反式脂肪酸釋放出來(lái)。在這種情況下，必須在側(cè)鏈脫保護(hù)之前將點(diǎn)切割出來(lái)并單獨(dú)處理。釋放的量也足以用于 HPLC 操作。

06 一般性評(píng)論

General remarks

SPOT 合成的最佳肽段長(zhǎng)度為 10 到 25 個(gè)殘基。超過(guò)這個(gè)長(zhǎng)度后，質(zhì)量就會(huì)慢慢下降，因?yàn)椴⒎撬�有的肽鏈都能完荃進(jìn)入。正如 RudolfVolkmer 小組的詳細(xì)分析所示，纖維外側(cè)較容易獲得的肽鏈甚至可以增長(zhǎng)到 50 個(gè)殘基的長(zhǎng)度。在這種情況下，通過(guò) Fmoc-和 Boc-beta- 丙氨酸混合物的耦合，膜的初始負(fù)載量至少應(yīng)減少 10-100 倍。肽的原始負(fù)載量通常比抗體結(jié)合所需的負(fù)載量高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)，甚至只有很少的正確序列能被檢測(cè)到。因此，在每個(gè)合成步驟中采用良好的封端程序，并通過(guò)軟件引導(dǎo)的機(jī)器人進(jìn)行可靠的氨基酸分配，在 N 端使用報(bào)告染料就可以對(duì)合成程序進(jìn)行簡(jiǎn)單的驗(yàn)證，讓人放心。

07 使用林克酰胺連接劑進(jìn)行 SPOT 合成的質(zhì)量控制

QC on SPOT synthesis using a Rink amide linker

在 MultiPep 1&2 合成器上合成肽陣列是一種廉價(jià)而方便的大量合成肽的方法。它們是通過(guò)沉積活化氨基酸液滴在纖維素膜支架上合成的。與第一份出版物相比，膜與第一個(gè)耦合氨基酸功能之間的結(jié)合穩(wěn)定性有所提高�，F(xiàn)在，它對(duì) 100% 的反式脂肪酸都很穩(wěn)定，在堿性條件下進(jìn)行檢測(cè)也不會(huì)導(dǎo)致肽的損失。這種鍵不能被裂解以釋放肽，而是保持共價(jià)連接，因此很難進(jìn)行質(zhì)量控制。如果在第一個(gè)循環(huán)中引入了可裂解連接體（如 Rink 酰胺連接體），則整個(gè)肽都可以用反式脂肪酸釋放出來(lái)。在這種情況下，必須在側(cè)鏈脫保護(hù)之前切出該點(diǎn)并單獨(dú)處理。

建議程序:
1. 根據(jù)儀器手冊(cè)設(shè)置合成。
2. 在合成的第一個(gè)循環(huán)中，將 FMOC-Rink 酰胺連接物引入所需的質(zhì)控肽。***質(zhì)控肽可在膜角附近合成，以便于去除。
3. 合成后，從儀器上取下干燥的膜并觀察斑點(diǎn)

• 使用手持式紫外線燈最容易做到這一點(diǎn)。然后用鉛筆圈出質(zhì)控點(diǎn)，再?gòu)哪ど霞粝隆?/span>
• 或者，為了使斑點(diǎn)顯現(xiàn)出來(lái)，可將膜浸泡在 DMF 溶液中的1% 溴酚藍(lán)中。斑點(diǎn)應(yīng)呈現(xiàn)淡藍(lán)色，其強(qiáng)度隨序列而變化。

4. 將切下的質(zhì)控點(diǎn)放入 1.5 mL 螺旋蓋微量離心管（或類似試管）中，加入 150 uL 通用裂解混合物（或自選混合物）。蓋緊試管蓋，培養(yǎng) 2-4小時(shí)。這將使肽從各自的林克酰胺連接體上裂解，并去除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。
5. 將含有已裂解多肽的上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的微量離心管中，并丟棄裝有已用斑點(diǎn)的離心管。
6. 使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序?qū)⑷芤和贶醺稍铮☉?yīng)注意強(qiáng)酸和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備）。
7. 用 10 uL 0.1 % 的反式脂肪酸重溶干肽。
8. 對(duì)該溶液進(jìn)行 MALDI分析，基質(zhì)一般為1μL 或更少。(注意 MW為 -1)

注：三氟乙酉夋(TFA)是一種揮發(fā)性很強(qiáng)的酸。整個(gè)裂解和加工過(guò)程必須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。在此階段必須佩戴安全眼鏡、手套和白大褂，并遵守所有安全規(guī)定。所有廢物必須按照國(guó)家規(guī)定進(jìn)行處理。

通用裂解混合物

• 92.5%(vv)三氟乙酉夋，TFA
• 5% (v/v) 三異丙基硅烷
• 2.5% (vv) 水

用于可裂解點(diǎn)的 Fmoc 鏈接器

Su et al.

Epigenetics&Chromatin volume 7, Article number:7(2014)，組合 PTM 組蛋白肽微陣列合成使用 RespepSL 自動(dòng)合成器(Intavis AG，KoIn，Germany,MultiPep 1CEM)在改性纖維素上合成肽。將Fmoc從 celluspot 中移除并耦合 Cy3(Lumiprobe,公司)后，就得到了纖維素-Cy3 染料共軛的斑點(diǎn)對(duì)照。空白細(xì)胞色斑對(duì)照組是通過(guò)去除色斑上的 Fmoc 并將試紙置于溶解條件下而制成的。對(duì)于肽，初始偶聯(lián)包括等摩爾量的Fmoc-Ala-OH 和 Boc-Ala-OH，以減少樹(shù)脂負(fù)載并提高合成質(zhì)量。每次合成的肽都含有可被酸裂解的鏈節(jié)，以便通過(guò)高效液相色譜法和質(zhì)譜法進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估(附加文件 12:表 S2)。此外還加入了 20 原子的聚乙烯連接體(PE)(Novabiochem 公司)，以提高合成效果和陣列中的蛋白質(zhì)結(jié)合力。Fmoc-Glu-(biotinyLPEG)-OH(Novabiochem)是鏈霉親和素的對(duì)照。

使用標(biāo)準(zhǔn)的 Fmoc/tBu 化學(xué)方法生成 13 氨基酸肽。如前文所述 [24]，肽的 PTM 以適當(dāng)保護(hù)的單體形式引入。合成完成后，用 82.5% 的三氣乙酸(TFA)去除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán):5% 硫代苯甲醚5% 水:5%二氯甲烷中的飽和苯酚:2.5%乙烷二硫醇，持續(xù) 90 分鐘(每個(gè)點(diǎn)150μ)。取出溶液，換上 250 μ的 88.5% 反式脂肪酸、4% 三氟甲磺酸、2.5% 三異丙基硅烷和 5% 水，輕輕攪拌過(guò)夜以溶解纖維素。用冷的二乙酉迷沉淀肽纖維素共軛物兩次，晾干幾分鐘，然后重新溶解到100μ 的二甲基亞砜(DMSO)中。

Boisguerin et al.

Chemistry & Biology, Vol. 11, 449–459, April, 2004，我們用與 PSD-95 PDZ3-結(jié)構(gòu)域結(jié)合的多肽 NYKQTSVCOOH 測(cè)試了硫醚環(huán)化的效率[148]。溴乙�；�肽(10)(粗體數(shù)字 10-12 參考圖 3.5 (A))是在幾個(gè)可裂解點(diǎn)上合成的(通過(guò)加入Fmoc-Rink 連接器實(shí)現(xiàn)可裂解性)。3 小時(shí)后，用反式脂肪酸將肽產(chǎn)物 h-1、h-2 和 h-3 從點(diǎn)上裂解，并用 HPLC 和 ESI-MS 進(jìn)行分析(圖 3.5 (B))。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的分析清楚地表明，在 h-3 條件下，硫醚-環(huán)化反應(yīng)的效率很高。為了確定肽序列對(duì)環(huán)化!清除步驟的影響，我們又合成了兩種膜結(jié)合溴乙�；�肽:EFHAALGSYVCOOH和 QHIDSQKKACOOH。

關(guān)于點(diǎn)合成的常見(jiàn)問(wèn)題

1. SPOT 合成的時(shí)間是什么時(shí)候?

使用雙偶聯(lián)方案合成 4x384 肽時(shí)，每個(gè)周期需要 2 個(gè)小時(shí)，最后處理需要 2-3 個(gè)小時(shí)。每個(gè)周期的操作時(shí)間約為 30 分鐘，用于制備活性衍生物和清洗膜。

2. 膜上肽的密度是多少?

標(biāo)準(zhǔn)密度為 10x15 厘米纖維素膜片上 600 個(gè)肽網(wǎng)格，中心到中心的距離為 4.2 毫米。也可以自由定義其他網(wǎng)格。在非常受控的條件下，纖維素膜上的密度可達(dá) 25x40 個(gè)點(diǎn)。

3. 一個(gè)點(diǎn)有多少肽?

我們提供的膜經(jīng)過(guò)衍生處理后，游離氨基的負(fù)載量約為 300-400 nmol/cm2。每個(gè)斑點(diǎn)的負(fù)載量可通過(guò)面積計(jì)算得出。

例如:一個(gè)直徑為6毫米的點(diǎn)約有 80 納摩爾的肽，一個(gè)直徑為3 毫米的點(diǎn)約有 20 納摩爾的肽。

4. 在 CelluSpots 合成過(guò)程中，應(yīng)選擇哪種品牌的濾紙放在框架下?

建議使用 Whatman 540 或 541

5. 乙�；�賴氨酸如何用于合成?

獲取 Fmoc-LyS(Ac)-OH，CAS#159766-56-0，并按照與 MultiPep 1&2 相同的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)方法進(jìn)行偶聯(lián)。

6. Ahx連接劑的親水性對(duì)應(yīng)物是什么?

建議使用 Fmoc-8-氨基-3,6-二氧雜辛酸。

7. 如何提高小規(guī)模濾板合成的產(chǎn)量?

使用 Ramage 樹(shù)脂(PC-01-0601)，用小容量裂解雞尾酒可立即裂解肽。

8. 如何使用 MultiPepRSi 或 RespepSL 合成 PNA 使用以下設(shè)置:

PNA 單體：0.3M 在 NMP 中使用新型偶聯(lián)劑
活化劑：HATU 或 PyAOP(0.6M 溶液);HATU 更穩(wěn)定，PyAOP 應(yīng)每天更新。
堿混合物：DIPEAV2,6-lutidine(1.2/1.8M，DMF 中)，兩種堿在 DMF 中的混合比例為20.09%(vvv)。

9. 如何減少消旋化?

在所有合成的肽中，外消旋化約占 1%。消旋化會(huì)使肽更加穩(wěn)定，從而導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊。苯丙氨酸和組氨酸會(huì)發(fā)生消旋化。組氨酸在 50C 或更高的溫度下很容易發(fā)生消旋化。DIC 和 OxymaPure 的組合可減少消旋化。PyOxim 和 NMM 的組合更易發(fā)生消旋化，但不如 HBTU 和 NMM 的組合。

10. 如何減少脫保護(hù)過(guò)程中天冬氨酸的形成?

在整個(gè)合成過(guò)程中，用 20% 的哌啶在 DMF（含 0.1M HCOOH）中對(duì) Fmoc 基團(tuán)進(jìn)行脫保護(hù)，以避免天冬酰亞胺副反應(yīng)。

11. 如何從 SPOT 膜上裂解多肽?

使用 Fmoc 鏈接劑作為第一個(gè)氨基酸。切出所需的點(diǎn)并涂上裂解液。Rink-Linker 會(huì)自行裂解并生成 C 端酰胺。

12. 我的 SPOT 肽中有一部分 N 端酰胺被乙�；�了。如何避免這種情況?

最后一個(gè)氨基酸使用叔丁氧羰基氨基酸。這樣可以避免濾紙和濾紙下方通道中的微量醋酸酐造成乙酰化。

13. 溶解了 NMP 的氨基酸可以保存多久?

除半胱氨酸和蛋氨酸外，氨基酸溶液可在 4℃ 下保存一個(gè)月。請(qǐng)注意，如果粉未變質(zhì)，丙氨酸和谷氨酸會(huì)產(chǎn)生沉淀。