InnoScan基于ANPMP標簽天然聚糖綜合分析新方法詳解

   
    摘要：聚糖通過碳水化合物-蛋白質相互作用介導各種生物過程，聚糖微陣列已成為理解這些機制不可或缺的工具。 然而，由于缺乏從糖復合物中獲得具有不同結構的天然聚糖文庫方便且通用的方法，功能糖組學的進展受到阻礙。 為了應對這一挑戰(zhàn)，中國一研究團隊開發(fā)了一種方法，可以對N/O-聚糖進行一鍋法釋放并同時捕獲、分離、結構表征和的功能分析。使用該方法，將糖綴合物與吡唑啉酮型異雙功能標簽-ANPMP 一起孵育以獲得聚糖-2ANPMP 綴合物，然后將其轉化為聚糖-AEPMP 綴合物。 該團隊從豬胃粘蛋白、大豆蛋白、人乳低聚糖等制備了一個標記聚糖文庫，通過 N-乙酰化和全甲基化衍生化后，通過 ESI-MSⁿ 分析對聚糖進行詳細的結構表征，結果揭示了超83個含有各種天然聚糖表位的高純度聚糖-AEPMP。構建鳥槍式微陣列來研究蛋白質和抗血清對聚糖的結合情況。
 
    碳水化合物是自然界中最豐富的生物大分子，在許多生物和病理過程中發(fā)揮著重要作用。人們對聚糖及其在生物醫(yī)學中的作用日益濃厚的興趣，引領了功能糖組學領域的發(fā)展。聚糖微陣列已被證明是一種成功的高通量篩選工具，可用于確定蛋白質-聚糖相互作用。擴展聚糖庫以包含更多樣化的結構對于推進功能糖組學至關重要。 盡管存在用于合成結構確定聚糖的化學或化學酶方法，但它們耗時、昂貴，并且需要大量勞動。 這限制了生物醫(yī)學相關聚糖的獲取，并阻礙了其確切生物學作用的確認。另一種途徑涉及從天然來源中釋放、標記和分離聚糖。 連接到糖蛋白的N/O-聚糖或連接到鞘糖脂的聚糖可以使用化學和酶促方法釋放。然而，N-聚糖釋放酶價格昂貴，并且僅適用于選定的底物。 相比之下，化學方法，例如肼解和堿解，會引起嚴重的脫乙酰和剝離副反應，并且需用有毒化學品。 由于缺乏裂解 O-聚糖的廣譜 O-糖苷酶，它們的釋放依賴于化學過程，例如通過Carlson 降解進行 β-消除或不進行醛還原。 然而，由于嚴重的剝離副反應，所得聚糖產(chǎn)物不能在還原端進一步衍生化或產(chǎn)率低。 最近發(fā)現(xiàn)家用漂白劑會釋放糖蛋白中所有類型的 N-聚糖和 O-聚糖，以及鞘糖脂中的聚糖腈。 然而，觀察到了副反應，且需要額外標記步驟來進一步純化和功能化。 由于聚糖上缺乏天然發(fā)色團、還原末端異構旋轉以及質譜 (MS) 靈敏度低，在高效液相色譜 (HPLC) 分離過程中監(jiān)測聚糖具有挑戰(zhàn)性。 此外，聚糖微陣列的制備通常需要用功能基團對聚糖進行衍生化。 因此，在釋放的聚糖上添加適用的熒光標簽可以更輕松、更有效地分離和固相固定。 聚糖微陣列的熒光標簽可以使用 2-氨基苯甲酰胺、2-氨基苯甲酸、2,6-氨基吡啶和 N-氨基乙基 2-氨基苯甲酰胺 (AEAB) 通過還原胺化來連接，或通過使用 2- 氨基甲基 N,O-羥乙基 (AMNO)、N-Fmoc-3-（甲氧基氨基）丙胺 (F-MAPA)和 O-芐基羥胺（ BHA）的N-烷基肟縮反應連接。 這些標簽已用于生成聚糖文庫，并成功應用于篩選聚糖結合蛋白（GBP）。 還原聚糖通常通過兩步過程用雙功能試劑進行化學衍生化獲得。 最近，報道了一種新的一鍋法，用于非還原性β-消除釋放和 O-原位標記。 使用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮 (PMP) 從糖蛋白中提取聚糖。通過這些方法，兩個主要步驟，非還原釋放和標記，可以同時進行，從而簡化了聚糖制備的樣品處理。 此外，雙-PMP聚糖衍生物在254 nm處表現(xiàn)出強烈的紫外線（UV）吸收，并且比其天然形式具有更高的疏水性，這有利于HPLC分離和UV檢測。 然而，這些方法不會產(chǎn)生帶有功能基團的聚糖來固定到載玻片上以產(chǎn)生微陣列。
 
該研究團隊提出了一種使用新型吡唑啉酮型異雙功能標簽2-(4-(3-甲基-5-氧代-4,5-二氫-吡唑唑-1-基)苯基)乙腈(ANPMP)的綜合方法 ，能夠對N/O-聚糖進行一鍋法釋放并同時捕獲、分離、結構表征和功能分析。 該標簽被設計為包含活性亞甲基和氰基功能基團。 在堿性條件下，它可以通過激活活性亞甲基與聚糖綴合，而氰基在聚糖 ANPMP 標簽綴合過程中保持穩(wěn)定，但之后可以轉化為活性氨基，以便有效固定在活化固相上用于制造聚糖微陣列。使用 ANPMP 在堿性介質中開發(fā)了一種高效、通用的先進一鍋法釋放和標記 N/O-聚糖和游離天然還原聚糖的方法，以驗證這些假設。 隨后，將聚糖-2ANPMP綴合物方便地轉化為聚糖-AEPMP（2-（4-（3-甲基-5-氧代-4,5-二氫-吡唑唑-1-基）苯基）乙胺）綴合物（聚糖-AEPMP） ，含有活性氨基的物質，通過HPLC分離，通過ESI-MS與MSⁿ技術進行結構表征，并制備成標記聚糖文庫。 此外，高純度聚糖-AEPMP 通過其游離烷基胺共價固定在 N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 酯活化的載玻片上，以生成鳥槍式天然聚糖微陣列，并進行功能研究。
 
   
           方法概述，用于制備糖基-AEPMP共軛物，并生成用于與凝集素和血清樣本進行研究的鳥槍式天然聚糖微陣列。
 
 
微陣列制備和檢測方法，詳述如下。AEPMP 標記的聚糖在磷酸鹽緩沖液（100 mM 磷酸鈉，pH 8.5）中重新溶解， 最終濃度為100 μM，并點樣到NHS-酯活化的載玻片上。 使用配備 PDC 80 壓電式噴頭（Scienion GmbH，柏林，德國）的 sciFLEXARRAYER S3 非接觸式點樣儀將聚糖噴點到載玻片上（每張載玻片上有 16 個子陣列）。 為每個聚糖打印四個重復點。 所有聚糖微陣列均打印為每張載玻片16 個子陣列，每個子陣列 336 個點。 液滴體積405 pL，并且打印緩沖液作為陰性對照。 打印后，載玻片在相對濕度設定為 65% 的加濕柜中于 25°C 下孵育，使聚糖與載玻片結合過夜。 然后將打印的載玻片用含有25 mM乙醇胺的100 mM 四硼酸鈉緩沖液（pH = 9.0）在 55 °C 下封閉 2 小時，使用 MilliQ 水洗滌兩次，干燥，并保存在 -20 °C 直至使用。
 
在微陣列檢測之前，通過安裝ProPlate 16孔微陣列模塊將每個子陣列分隔開，并使用100 μL TSMTB緩沖液（20 mM Tris.HCl，150 mM氯化鈉，0.2 mM氯化鈣，0.2 mM氯化鎂，0.05％（v/v）Tween®20，1％（w/v）BSA，pH 7.4）重新水合10分鐘。進行分析時，吸除TSMTB緩沖液，并加入100 μL 含GBPs的PBST緩沖液或含適當濃度血清樣本的TSMTB緩沖液。微陣列載玻片用明確定義的生物素化凝集素和血清樣本進行探測。將載玻片密封并在輕柔搖動下孵育2小時，然后用PBST和PBS緩沖液洗滌四次。接下來，向每個子陣列添加100 μL熒光標記的二抗或Cy3-偶聯(lián)鏈霉素（Cy3-SA），密封并在輕柔搖動下孵育1小時。生物素化凝集素（Vector Labs）除AAL和Con A外，均以10 μg/mL進行分析（AAL和Con A以1 μg/mL進行分析），結合的凝集素通過與Cy3-SA（1.0 μg/mL；Solarbio）的二次孵育進行確認。采用Alexa Fluor 488-偶聯(lián)的兔抗人IgG（5 μg/mL；SouthernBiotech）和Alexa Fluor 488-偶聯(lián)的山羊抗人IgM（5 μg/mL；Abcam）用于檢測結合情況。孵育后，載玻片依次用PBST、PBS緩沖液和MilliQ水洗滌四次，然后經(jīng)過簡短離心干燥以進行掃描。使用來自Innopsys公司（法國）的InnoScan 710-G微陣列掃描儀對載玻片進行成像。獲得的圖像使用Innopsys公司Mapix 8.5微陣列分析軟件進行分析，然后使用Microsoft Excel處理以獲取微陣列結果。在手動對齊每個子陣列與綠色通道中微弱可見的聚糖斑點后，進行信號定量。以下方程計算信號：平均數(shù)據(jù)=四個重復熒光強度均值-背景強度熒光強度均值。從至少三個獨立實驗計算變異系數(shù)。
   
 
 
 
文獻原文鏈接：  https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.121617