機(jī)械解離組織活檢的單細(xì)胞物理表型分析在臨床快速診斷評(píng)估中的應(yīng)用

在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，技術(shù)的進(jìn)步常常意味著更快、更準(zhǔn)確的診斷和治療方法。而今，我們引領(lǐng)醫(yī)學(xué)進(jìn)步的道路，帶來了一項(xiàng)革命性的技術(shù)——TIGR組織研磨分離儀，以下簡(jiǎn)稱TG。這項(xiàng)技術(shù)將徹底改變我們對(duì)于細(xì)胞診斷的認(rèn)識(shí)，讓醫(yī)學(xué)界邁入了一個(gè)全新的時(shí)代。

TG，是一種基于反向旋轉(zhuǎn)的機(jī)械解離裝置。通過預(yù)先編程的交替切割和研磨步驟，它能夠快速、高效地從固體組織中分離出單個(gè)活性細(xì)胞，無需使用酶類試劑。這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)不僅在于快速，更在于保留了細(xì)胞的生物活性和形態(tài)完整性，為后續(xù)的診斷和治療提供了可靠的基礎(chǔ)。
 

手術(shù)期間快速準(zhǔn)確的組織病理診斷對(duì)臨床決策至關(guān)重要。目前常用的術(shù)中咨詢病理學(xué)方法耗時(shí)、勞動(dòng)力成本高，并需要受過訓(xùn)練的病理學(xué)家的專業(yè)知識(shí)。

在這里，研究團(tuán)隊(duì)引入了一種替代技術(shù)（快速、無標(biāo)記的固體組織活檢診斷方法），通過依次評(píng)估懸浮的單個(gè)細(xì)胞的物理表型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)活檢樣本進(jìn)行快速、無標(biāo)記的分析。該方法結(jié)合了使用TIGR組織研磨分離儀進(jìn)行無酶機(jī)械解離組織，快速簡(jiǎn)便地分離出活性單個(gè)細(xì)胞，以及使用RT–FDC對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞物理表型進(jìn)行順序評(píng)估。

這種新的診斷流程將組織的無酶機(jī)械解離與測(cè)量速率為100-1,000個(gè)細(xì)胞/秒的實(shí)時(shí)可變形細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和基于機(jī)器學(xué)習(xí)的分析相結(jié)合。從單個(gè)細(xì)胞的明場(chǎng)圖像中提取的物理表型參數(shù)可以用于區(qū)分各種組織中的細(xì)胞亞群，而無需先驗(yàn)知識(shí)或分子標(biāo)記。此外，我們展示了我們的方法在炎癥性腸病診斷中的潛力。通過無監(jiān)督的維度降低和邏輯回歸，我們準(zhǔn)確區(qū)分了小鼠和人類活檢樣本中的健康和腫瘤組織。該方法在30 min內(nèi)提供結(jié)果，為快速、無標(biāo)記的診斷流程奠定了基礎(chǔ)，以檢測(cè)固體活檢中的病理變化，適用于術(shù)中診斷和病理變化。

這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用范圍廣泛，不僅可以用于研究領(lǐng)域的細(xì)胞分析，也可以在臨床診斷中大顯身手。

優(yōu)勢(shì)1
TG配合RT-FDC技術(shù)先進(jìn)的微流控芯片，有高速相機(jī)和智能數(shù)據(jù)處理軟件，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)形態(tài)學(xué)、機(jī)械和熒光參數(shù)的獲取和分析。RT-FDC技術(shù)通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)和變形，還可以通過分析細(xì)胞的變形、大小等參數(shù),為科研人員提供了更加豐富的數(shù)據(jù)維度, 進(jìn)行更加精準(zhǔn)的診斷，甚至可以用于癌癥的早期檢測(cè)和疾病的預(yù)后評(píng)估。

優(yōu)勢(shì)2
除此之外，TG還具有無酶、高通量的特點(diǎn)，使其在臨床應(yīng)用中具備了巨大的優(yōu)勢(shì)。它不僅可以用于術(shù)中診斷，還可以用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展和治療效果，為臨床醫(yī)生提供了更加及時(shí)、精準(zhǔn)的診斷和治療方案。
 

首先，我們篩選了不同的小鼠組織，并評(píng)估了機(jī)械解離組織后的細(xì)胞產(chǎn)量、存活率以及RT–FDC測(cè)量的可行性。我們展示了僅基于圖像提取的物理參數(shù)就可以區(qū)分組織細(xì)胞的亞群，而無需先驗(yàn)知識(shí)或額外的分子標(biāo)記，這可以增強(qiáng)傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)。我們還展示了我們的方法可以通過在微流控系統(tǒng)中測(cè)量細(xì)胞變形來確定結(jié)腸組織中的炎癥變化。此外，我們還檢查了來自小鼠和人類結(jié)腸的冷凍和新鮮活檢樣本，并通過主成分分析（PCA）和機(jī)器學(xué)習(xí)對(duì)多維數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，展示了RT–FDC可以區(qū)分健康和癌變組織。這些發(fā)現(xiàn)表明，使用RT–FDC評(píng)估組織來源的單個(gè)細(xì)胞的物理表型是一種檢測(cè)炎癥或惡性狀態(tài)的替代策略。我們的流程可以在30 min內(nèi)提供結(jié)果，并可以在不偏見和無標(biāo)記的情況下識(shí)別和表征組織中的細(xì)胞群體的潛力。

結(jié)果
機(jī)械解離組織的物理表型
在評(píng)估細(xì)胞的物理表型之前，面臨的第一個(gè)挑戰(zhàn)是在幾分鐘的時(shí)間內(nèi)快速?gòu)墓腆w組織中提取單個(gè)細(xì)胞，同時(shí)旨在最大程度準(zhǔn)確地代表細(xì)胞亞群的異質(zhì)性。為此，我們使用了TG，這是一種基于反向旋轉(zhuǎn)的研磨齒的機(jī)械解離裝置（圖1），裝在錐形底離心管中。該裝置自動(dòng)執(zhí)行預(yù)定義的交替切割和研磨步驟，以從固體組織中分離出單個(gè)細(xì)胞。使用TG或常規(guī)酶解方案處理了十種不同的小鼠組織進(jìn)行比較。大多數(shù)組織的存活率為70–90％；細(xì)胞產(chǎn)量與酶解離相似且取決于組織種類。機(jī)械解離的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)在于處理時(shí)間不到5 min/樣本，而不是酶解方法的數(shù)十分鐘甚至幾個(gè)小時(shí)。處理速度可能有助于接近原位條件以此來保留生化和生物物理表型。
 

圖1| 物理表型分析過程示意圖

組織樣品被切割成小塊并放入含有培養(yǎng)基的組織研磨器內(nèi)轉(zhuǎn)子中。通過預(yù)先編程的自動(dòng)執(zhí)行的順時(shí)針和逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)序列進(jìn)行機(jī)械解離。解離的細(xì)胞被離心并懸浮在測(cè)量緩沖液中。樣品被加載到微流控芯片上，并使用RT-FDC進(jìn)行分析。對(duì)典型的大約10,000個(gè)細(xì)胞的每個(gè)單個(gè)的亮場(chǎng)圖像進(jìn)行捕獲。從圖像中提取各種特征，用于多維分析�？偟膩碚f，從組織到結(jié)果的整個(gè)過程不到30 min。

使用組織的機(jī)械解離和基于物理表型的無標(biāo)記分析時(shí)，對(duì)于肝臟這樣的特定組織，這種方法是否能夠真實(shí)地代表組織中存在的細(xì)胞類型的分布進(jìn)行了仔細(xì)研究。在小鼠肝組織解離后，通過細(xì)胞形態(tài)和大小測(cè)量，確定橫截面細(xì)胞面積大于150平方微米的細(xì)胞為肝細(xì)胞。肝細(xì)胞是肝臟的主要實(shí)質(zhì)細(xì)胞，占肝細(xì)胞總數(shù)的70％，近80％的肝臟體積。使用TG獲得的細(xì)胞懸液中，肝細(xì)胞占總細(xì)胞的平均比例為52.5％，通過機(jī)械解離獲得的細(xì)胞懸液中與酶解消化相比更接近組織中的真實(shí)比例。利用細(xì)胞大小識(shí)別不同的肝細(xì)胞亞群，這些亞群與不同倍性的肝細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。

在RT-FDC測(cè)量中，數(shù)百個(gè)單個(gè)細(xì)胞懸浮在高粘度的甲基纖維素緩沖液中，經(jīng)過微流控通道狹縮。在這個(gè)過程中，細(xì)胞受到剪切應(yīng)力和壓力梯度的影響，導(dǎo)致其變形，并且每個(gè)細(xì)胞的圖像被獲取。通過實(shí)時(shí)計(jì)算圖像中的幾個(gè)物理參數(shù)，包括細(xì)胞的變形、大小、亮度、亮度標(biāo)準(zhǔn)差、長(zhǎng)寬比和面積比。此外，通過熒光模塊檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)情況。

圖2展示了從肝臟、結(jié)腸和腎臟中提取的細(xì)胞的物理參數(shù)分布示例。每個(gè)聚類代表具有相似物理表型和表面標(biāo)記表達(dá)的細(xì)胞組成的群體。通過圖像派生的物理參數(shù)，例如細(xì)胞大小和平均亮度，可以純粹地區(qū)分出上皮細(xì)胞群體，而無需使用額外的熒光抗體面板。在結(jié)腸上皮細(xì)胞中，可以根據(jù)亮度和大小確定多個(gè)細(xì)胞聚類。在腎臟的白細(xì)胞群體中，也可以基于細(xì)胞大小和變形參數(shù)找到不同的聚類。
 

圖2| 小鼠肝臟、結(jié)腸和腎臟樣本細(xì)胞物理參數(shù)的說明性散點(diǎn)圖

a，從肝臟分離的細(xì)胞的平均亮度與細(xì)胞大小的代表性散點(diǎn)圖，顯示大量細(xì)胞簇。標(biāo)記的細(xì)胞群（形成細(xì)胞大小為 25-50 μm2 且亮度平均值在 100-115形成了一個(gè)明顯的簇）富含 EpCAM 陽(yáng)性（上皮）細(xì)胞，但不含 CD31 陽(yáng)性（內(nèi)皮）細(xì)胞或 CD45 陽(yáng)性細(xì)胞（白細(xì)胞））。FITC，異硫氰酸熒光素；PE、藻紅蛋白；APC，別藻藍(lán)蛋白。b，EpCAM 和 CD45 細(xì)胞表面標(biāo)記染色的結(jié)腸細(xì)胞的說明性散點(diǎn)圖。在 EpCAM 陽(yáng)性群體中，可以根據(jù)物理參數(shù)（例如亮度和細(xì)胞大小）的密度圖可以區(qū)分7個(gè)細(xì)胞亞群。c，EpCAM 和 CD45 染色的腎細(xì)胞的說明性散點(diǎn)圖。在 CD45 群體中，根據(jù)細(xì)胞大小和變形的相似性確定了4個(gè)亞群。散點(diǎn)圖中的顏色圖表示事件密度。

RT–FDC還可用于捕獲細(xì)胞相互作用。使用長(zhǎng)寬比和細(xì)胞大小參數(shù)，我們?cè)谛叵佟⑵⑴K和腎臟樣本中確定了細(xì)胞雙體。許多雙體由兩種不同的細(xì)胞類型組成，根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記來判斷（圖3）。通道內(nèi)的細(xì)胞位置與熒光峰的位置相結(jié)合，使我們能夠確定，例如，雙體由白細(xì)胞（CD45+）和內(nèi)皮細(xì)胞（CD31+）組成。使用RT–FDC排序模塊，可以無標(biāo)記地分離細(xì)胞雙體進(jìn)行進(jìn)一步的分子分析和下游應(yīng)用，包括對(duì)組織中相互作用的免疫細(xì)胞進(jìn)行研究。
 

圖3| 使用RT-FDC檢測(cè)細(xì)胞二聚體

代表性的細(xì)胞從小鼠a胸腺，c脾臟和e腎臟 分離的細(xì)胞大小與縱橫比的散點(diǎn)圖，顯示了識(shí)別細(xì)胞二聚體的門控策略。在b胸腺和d脾臟中鑒定的細(xì)胞二聚體及f腎臟中的對(duì)應(yīng)熒光跡線（b、d），顯示了白細(xì)胞（CD45）與內(nèi)皮細(xì)胞（CD31）相連接，或（f）兩個(gè)白細(xì)胞的相互作用。

人組織制備
從埃爾蘭根病理學(xué)研究所獲得的腫瘤或健康組織手術(shù)切除的人類活檢樣本，立即置于含有10% 胎牛血清（FBS）、1% GlutMAXTM、1% HEPES和1% 青霉素/鏈霉素的DMEM Advanced培養(yǎng)基中，并存放在4 °C下，立即處理或在液氮中冷凍以備后用。

組織解離和單細(xì)胞制備
使用TissueGrinder（TG）進(jìn)行組織解離。簡(jiǎn)單地說，將組織樣本切成約1-2 mm大小的小塊，并放入800μL含有2% FBS的DMEM于TG的轉(zhuǎn)子中。將轉(zhuǎn)子單元放置在一個(gè)50 ml離心管的蓋子中，帶有100 μm細(xì)胞篩的定子插入到轉(zhuǎn)子的頂部。將50 ml離心管放置在蓋子上，旋緊并放置在TissueGrinder設(shè)備上（見圖1）。每種組織類型的研磨過程參數(shù)總結(jié)在表1中。在研磨過程之后，將離心管倒置到架子上，打開，并用5 ml DMEM，2% FBS沖洗細(xì)胞過濾器。流過物被轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中，并在300 g離心8 min。然后抽取上清液，將細(xì)胞沉淀用2 ml PBS(含2% FBS)洗滌，通過帶有細(xì)胞過濾器蓋的FACS管，并在300 g離心5 min。將細(xì)胞沉淀懸浮在高粘度測(cè)量緩沖液中，該緩沖液由稀釋在無鈣鎂磷酸鹽緩沖液（PBS）中的0.6%（w/w）甲基纖維素（4,000 cPs; Alfa Aesar）制備而成。
 

表1：用于機(jī)械解離的小鼠器官和相應(yīng)的TG方案流程，以及用于RT-FDC測(cè)量的微流控芯片大小

通過細(xì)胞的物理表型來鑒定組織炎癥
炎癥性腸�。↖BD），如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，是與受損的上皮/黏膜屏障以及免疫細(xì)胞的激活/招募相關(guān)的腸道慢性炎癥性疾病。盡管IBD的病因尚未完全理解，但我們對(duì)IBD的理解很大程度上來自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究。其中一種模型是將原始T細(xì)胞轉(zhuǎn)移入Rag1缺陷小鼠中誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎（慢性結(jié)腸炎的T細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型，以下簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)移性結(jié)腸炎）。然后通常通過來自結(jié)腸組織的用伊紅染和伊妥珠染的切片生成的組織病理學(xué)評(píng)分來量化其嚴(yán)重程度。

在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸炎動(dòng)物模型中對(duì)結(jié)腸細(xì)胞的物理表型變化進(jìn)行的調(diào)查。通過細(xì)胞的變形與大小的散點(diǎn)圖（見圖4），發(fā)現(xiàn)疾病組織中的細(xì)胞似乎比健康組織中的細(xì)胞變形較小。在檢查CD45+細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性結(jié)腸炎樣本中存在大量變形較小的白細(xì)胞，可能是淋巴細(xì)胞�？傮w上，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸炎樣本的中位數(shù)變形顯著減少，并且伴隨著白細(xì)胞百分比的顯著增加，符合淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。細(xì)胞的中位數(shù)變形與白細(xì)胞百分比呈強(qiáng)烈的負(fù)相關(guān)。此外，細(xì)胞大小和變形的中位數(shù)值與專家的組織病理學(xué)評(píng)分相關(guān)。值得注意的是，健康組織比患病組織更難機(jī)械分離成單個(gè)細(xì)胞，患病組織產(chǎn)生了更多的分析事件。

我們觀察到，在炎癥期間細(xì)胞的物理表型發(fā)生變化，加上越來越多的證據(jù)表明慢性炎癥與惡性腫瘤相關(guān)，這導(dǎo)致我們推測(cè)我們的方法可能會(huì)檢測(cè)到腫瘤活檢樣本的變化。我們證實(shí)了這種可能性，對(duì)于小鼠和人類樣本都是如此。

圖4| 通過 RT-FDC 進(jìn)行的細(xì)胞物理表型反映了組織炎癥

a，與健康小鼠結(jié)腸組織（對(duì)照）相比，從轉(zhuǎn)移結(jié)腸炎組織樣本（TC）分離的細(xì)胞的細(xì)胞大小與形變散點(diǎn)圖；具有相應(yīng)的細(xì)胞大小和變形直方圖。
b，對(duì)相同的兩個(gè)結(jié)腸樣本進(jìn)行CD45陽(yáng)性細(xì)胞門控，顯示轉(zhuǎn)移結(jié)腸炎樣本中白細(xì)胞的富集，并伴隨著物理表型參數(shù)的變化。散點(diǎn)圖中的顏色圖表示事件密度。
c，a 和 b 中所示樣本的核密度估計(jì)圖，其中等高線標(biāo)記為 0.5（淺色陰影，外輪廓）和 0.95（深色陰影，內(nèi)輪廓）水平。
d， 中值變形和CD45陽(yáng)性細(xì)胞百分比的量化（三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中n = 14只生物學(xué)獨(dú)立的動(dòng)物）。方框從第 25 個(gè)百分位延伸到第 75 個(gè)百分位，中間有一條線；晶須跨越 1.5 倍四分位距。使用雙邊Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。
e，所有細(xì)胞變形中值與白細(xì)胞（CD45+細(xì)胞）比例的雙邊Pearson相關(guān)性；P = 0.0065和r = −0.69。

區(qū)分小鼠結(jié)腸中的腫瘤組織與健康組織
我們的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的細(xì)胞的機(jī)械特性與對(duì)照樣本顯著不同，表明我們的方法在檢測(cè)結(jié)直腸癌方面具有潛力。圖5a-c中單個(gè)小鼠的代表性圖表顯示，腫瘤中的細(xì)胞與其健康對(duì)應(yīng)物相比，細(xì)胞大小更大，變形更高。對(duì)所有32個(gè)樣本的分析表明，腫瘤中的細(xì)胞具有顯著較高的平均細(xì)胞大小、變形和面積比，效應(yīng)大小從中等到強(qiáng)（圖5d、e和g）。腫瘤樣本還表現(xiàn)出更大的異質(zhì)性，如圖5c中廣泛的分布以及細(xì)胞大小和面積比的標(biāo)準(zhǔn)偏差顯著增加（圖5d和g）。
 

圖5 | 小鼠結(jié)腸組織中腫瘤和健康組織細(xì)胞的物理表型分析

研究團(tuán)隊(duì)在驗(yàn)證他們的方法在不同器官組織上的有效性時(shí)所采取的步驟和結(jié)果。他們將方法應(yīng)用于來自9名癌癥患者的新鮮切除的肺活檢樣本，并使用主成分分析（PCA）結(jié)合邏輯回歸來區(qū)分健康樣本和腫瘤樣本。結(jié)果顯示，他們的方法能夠很容易地將7個(gè)健康樣本與7個(gè)腫瘤樣本分開，并且進(jìn)一步正確分類了4個(gè)盲樣本。在PCA中，PC1和PC2解釋了46.9%的方差，其中變形參數(shù)對(duì)PC1有很大的貢獻(xiàn)，表明細(xì)胞可變形性測(cè)量所帶來的獨(dú)特信息對(duì)于區(qū)分腫瘤和健康組織是有用的。此外，研究團(tuán)隊(duì)還測(cè)試了他們的方法對(duì)于只存在少量癌細(xì)胞的情況的敏感性，如低腫瘤細(xì)胞度和廣泛的成纖維性腫瘤基質(zhì)含量的腫瘤，或者經(jīng)過化學(xué)或放射化療后幾乎完全緩解的腫瘤。他們的方法成功地將一個(gè)由50%健康和50%腫瘤組織組成的樣本分類為腫瘤樣本，即使在存在極少量癌細(xì)胞的情況下，也能正確地分類樣本為腫瘤。

參考文獻(xiàn)：Rapid single-cell physical phenotyping of mechanically dissociated tissue biopsies | Nature Biomedical Engineering

我司將致力于將這項(xiàng)革命性的技術(shù)帶給更多的醫(yī)療機(jī)構(gòu)和患者。我們相信，組織研磨分離儀將成為未來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要工具，為人類健康事業(yè)作出更大的貢獻(xiàn)。

讓我們攜手邁入醫(yī)學(xué)技術(shù)的新時(shí)代，讓組織研磨分離儀成為醫(yī)學(xué)界的強(qiáng)大助力！