活細胞成像儀助力腫瘤球形成全周期成像

傳統(tǒng)的二維（2D）細胞體外培養(yǎng)，即細胞在單層中生長，已被用作評估生物活性分子的生物學(xué)性能工具，多用于治療如帕金森病、艾滋病毒、糖尿病或癌癥等不同的疾病。然而，單層細胞培養(yǎng)無法模擬腫瘤微環(huán)境元素及腫瘤球3D組織所賦予的結(jié)構(gòu)和耐藥性，而3D球體能夠準確模擬實體瘤的某些特征，如空間結(jié)構(gòu)、生理反應(yīng)、可溶性介質(zhì)分泌、基因表達模式和耐藥機制等，因此3D細胞培養(yǎng)模型已經(jīng)成為一個有前途的平臺篩選抗癌療法。

3D腫瘤球培養(yǎng)方法

• 基于支架的3D細胞培養(yǎng)（水凝膠和插入物）

在基于支架的3D培養(yǎng)中，細胞生長到模擬細胞外基質(zhì)（ECM）結(jié)構(gòu)的3D支架上。這些支架可由天然（如膠原蛋白）、半合成（如殼聚糖）或合成（如聚己內(nèi)酯）生物材料組成，復(fù)合材料可以在孔隙率、滲透性等方面很好的模擬天然細胞外基質(zhì)，模擬細胞與細胞間的相互作用以及細胞與細胞外基質(zhì)間的相互作用，允許細胞在支架上聚集、增殖和遷移。

• 基于非支架的3D細胞培養(yǎng)

非支架的3D細胞培養(yǎng)是一種簡單的細胞培養(yǎng)方法，無需額外材料，利用細胞排斥材料處理的細胞培養(yǎng)器皿或使用懸滴等特殊系統(tǒng)開展細胞培養(yǎng)，避免細胞在培養(yǎng)皿表面黏附，使其聚集成團，從而形成細胞微球。

腫瘤球狀細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵特征

• 細胞異質(zhì)性和細胞-細胞信號傳導(dǎo)

腫瘤球狀體可僅由癌細胞（同型球狀體）或癌細胞與其他類型細胞（異型球狀體），如成纖維細胞、內(nèi)皮細胞（如HUVECs或免疫細胞組成。此外，異型球狀體可以有不同的癌癥與基質(zhì)細胞的比例，以更好地模擬實體腫瘤中發(fā)現(xiàn)的細胞異質(zhì)性。此外，在3D球狀體中，所有細胞密切接觸生長，從而復(fù)制了在實體腫瘤中觀察到的信號通路。

• 3D腫瘤球狀體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)

與實體瘤一樣，球形細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)由不同的細胞層組成（圖 1B）。外層由增殖率高的細胞組成，中層主要由衰老細胞組成，核心則是壞死細胞。球形外圍細胞的高增殖率是因為它們更容易獲得氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。相比之下，球體內(nèi)的細胞由于缺乏氧氣（缺氧）和營養(yǎng)物質(zhì)而處于衰老或壞死狀態(tài)。細胞層中的球形組織是導(dǎo)致抗癌藥物或載藥納米載體療效受損的原因。在球形體的內(nèi)層，即缺氧區(qū)，藥物通過形成活性氧促進細胞死亡的療效降低。

• 球狀體中ECM沉積、ECM-細胞和細胞-細胞的物理相互作用

3D球體內(nèi)的細胞會沉積 ECM 成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、腱鞘蛋白和其他成分。球體 ECM-細胞（α5- 和 β1-整合素）和細胞-細胞物理接觸（如 E-粘連蛋白）形成了一道屏障，限制了抗癌化合物在腫瘤組織中的滲透和分布。此外，ECM蛋白的沉積和密切的物理相互作用增加了球狀體密度，導(dǎo)致了組織流體壓力（IFP）的增加。

• 3D腫瘤球狀體生長動力學(xué)

實體腫瘤的生長可分為兩個主要階段。在生長期，實體瘤的體積呈指數(shù)級增長，這也是無血管的生長階段。之后細胞生長保持在休眠階段，血管快速生長階段開始。隨后，癌細胞獲得侵襲性并轉(zhuǎn)移到遠處。在球體中也發(fā)現(xiàn)了類似的生長模式，即在早期階段，球體體積呈指數(shù)增長，直到直徑達到200-500μm；隨后，體積增長率開始減小，直到球體體積保持不變。這種生長曲線對于建立球狀體的層狀組織至關(guān)重要。

• 3D腫瘤球狀體：基因表達譜

細胞基因表達譜受到微組織特有的3D細胞組織的強烈影響。球體內(nèi)的基因表達模式與在體內(nèi)實體瘤中觀察到的模式相似。研究者分析并比較了黑色素瘤細胞2D和3D球形培養(yǎng)物中編碼趨化因子、促血管生成因子和細胞粘附分子的 179 個基因的表達模式，結(jié)果表明，大量基因在三維球形培養(yǎng)物中過度表達。這些過表達的基因在皮膚癌的進展、侵襲和壞死中起著至關(guān)重要的作用。此外，模擬結(jié)直腸癌、間皮瘤和肝臟肝細胞癌的三維球狀細胞也有類似的結(jié)果。
 
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我們挑選了一篇使用JuLI™ Stage活細胞成像分析系統(tǒng)應(yīng)用在腫瘤球形成方向的代表性文章，來自艾克斯-馬賽大學(xué)馬賽癌癥研究中心(CRCM)的研究團隊在《EBioMedicine》期刊發(fā)表題為'Beta-blockers disrupt mitochondrial bioenergetics and increase radiotherapy efficacy independently of beta-adrenergic receptors in medulloblastoma'的文章[2]，研究人員使用JuLI™ Stage活細胞成像分析系統(tǒng)實時監(jiān)測球狀體生長，在第0天、第7天、第14天以及第21天進行拍照，對比不同處理組球體生長變化。結(jié)果表明，低濃度的β受體阻滯劑顯著增強了臨床相關(guān)的放射治療方案的效果。 盡管患者活檢顯示可檢測到B-腎上腺素能受體表達，但重新利用的藥物增強電離輻射的能力并不是由于抑制了信號通路。研究強調(diào)，組合治療的功效取決于代謝阻滯，該阻滯剝奪了髓母細胞瘤的適應(yīng)性生物能量學(xué)能力。這導(dǎo)致超氧自由基的過量產(chǎn)生，并最終導(dǎo)致電離輻射介導(dǎo)的DNA損傷增加。
參考文獻：
[1]Costa EC, Moreira AF, de Melo-Diogo D, Gaspar VM, Carvalho MP, Correia IJ. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnol Adv. 2016 Dec;34(8):1427-1441.（IF16.0）
[2]Rossi M, Talbot J, Piris P, Grand ML, Montero MP, Matteudi M, Agavnian-Couquiaud E, Appay R, Keime C, Williamson D, Buric D, Bourgarel V, Padovani L, Clifford SC, Ayrault O, Pasquier E, André N, Carré M. Beta-blockers disrupt mitochondrial bioenergetics and increase radiotherapy efficacy independently of beta-adrenergic receptors in medulloblastoma. EBioMedicine. 2022 Aug;82:104149.（IF11.1）