iPSC維持、培養(yǎng)和表征過程中的實(shí)用方法和工具

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）下文簡稱iPSC，是指通過導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子將終末分化的體細(xì)胞重編程為多能性干細(xì)胞。iPSC在2006年日本科學(xué)家山中申彌的實(shí)驗(yàn)中誕生，從全球來看，已有多款iPSC細(xì)胞治療產(chǎn)品處于臨床研究階段。
 
近年來，細(xì)胞療法在癌癥治療領(lǐng)域取得了豐碩的結(jié)果，但免疫細(xì)胞療法不管是在血液瘤還是實(shí)體瘤領(lǐng)域都面臨著細(xì)胞來源不足或質(zhì)量不均的問題，iPSC衍生的細(xì)胞成為了一種極佳的選擇。iPSC逐步成為細(xì)胞治療領(lǐng)域的重要臨床研發(fā)方向。
 
下面給大家來介紹在iPSC維持、培養(yǎng)和表征過程中有哪些好用的方法和工具：
 
 
iPSC分離挑取
 
iPSC在維持和培養(yǎng)過程中一致性和可重復(fù)性的數(shù)據(jù)至關(guān)重要，手動(dòng)挑取iPSC可能產(chǎn)生更多的陽性細(xì)胞，在干細(xì)胞集落的分離轉(zhuǎn)移過程中也相當(dāng)有挑戰(zhàn)。這時(shí)候一臺(tái)快速、溫和的全自動(dòng)無損細(xì)胞分離系統(tǒng)就可以滿足您的需求，CellCelector Flex具有專門為貼壁細(xì)胞和細(xì)胞克隆設(shè)計(jì)的挑取模塊，能夠溫和且高度特異性地分離靶細(xì)胞，非常適合分離單個(gè)干細(xì)胞、干細(xì)胞集落并進(jìn)行傳代，并且能夠分離干細(xì)胞集落的特定部分�？勺畲蟪潭忍岣咚�挑選的干細(xì)胞克隆的存活率和克隆性，同時(shí)保持其多功能性特征。
 

圖1. 使用 CellCelector Flex 可以精準(zhǔn)、快速、溫和且可靠地挑取 iPSC。
使用 CellCelector 平臺(tái)拍攝的顯微照片，照片中突出顯示了系統(tǒng)選擇的 iPSC 集落。(A) 和 (B) 分別為手動(dòng)和 CellCelector 挑取并接種的 iPSC 集落，用碘化丙啶 (PI) 染色以鑒別死亡細(xì)胞。顯微照片 (C) 顯示了 CellCelector 挑取之前，干細(xì)胞集落中的一個(gè)分化區(qū)域。(D) 是 (C) 中所示的培養(yǎng)板區(qū)域分離分化部分后的顯微照片。(E) 是挑取多能細(xì)胞部分之前，飼養(yǎng)細(xì)胞層上生長的大型 iPSC 集落的顯微照片。集落右下角有自發(fā)分化的跡象。(F) 是使用 CellCelector Flex 挑取 (E) 中的集落后的顯微照片，CellCelector靶向收集并轉(zhuǎn)移了多能細(xì)胞區(qū)域用于進(jìn)一步培養(yǎng)。比例尺等于 500 µm。
 
 
iPSC生長監(jiān)測

而在 iPSC 培養(yǎng)過程中監(jiān)測形態(tài)和多能潛力又是另一個(gè)挑戰(zhàn)，如何能直觀的監(jiān)測脆弱的iPSC細(xì)胞培養(yǎng)物？這時(shí)候Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析平臺(tái)就體現(xiàn)出了它特有的優(yōu)勢(shì)，在您的實(shí)驗(yàn)中，無需從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板即可監(jiān)測脆弱的 iPSC 細(xì)胞系培養(yǎng)物的形態(tài)和生長特征。下面讓我們來看看實(shí)際案例中，Incucyte®是如何發(fā)揮它的作用的：
 
使用 Incucyte Cell-by-Cell貼壁細(xì)胞模式在10x放大倍數(shù)下掃描其形態(tài)差異并自動(dòng)進(jìn)行定量分析。通過 Basic Analyzer 和 AI 活細(xì)胞匯合度分析測定細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)面積（圖 3C和F），然后按以下公式計(jì)算核質(zhì)比（研究 iPSC 的標(biāo)準(zhǔn)測量值）：  

圖2. 在 iPSC 培養(yǎng)過程中監(jiān)測形態(tài)和多能潛力。 
在優(yōu)化 (mTESR Plus) 和未優(yōu)化 (RPMI) 條件下生長的 iPSC 的 Incucyte® 圖像。（A、D）經(jīng) Nuclight 快速紅色染料染色后的 iPSC 熒光圖像，比較了不同條件下的細(xì)胞核密度。（B、E）相同 iPSC 的相差圖像，顯示出兩個(gè)變量之間的形態(tài)差異。（C、F）Incucyte® 上的圈描分析顯示了匯合度和核熒光面積，可用于確定核質(zhì)比，如 (G) 中所示。比例尺等于 400 µm。
 
 
iPSC功能表征
 
最后在細(xì)胞表征過程中，同樣可以用到賽多利斯iQue® 流式細(xì)胞儀 表征珍貴細(xì)胞類型，每個(gè)樣品僅需 10 µL，充分節(jié)省樣品以滿足下游需求，同時(shí)ForeCyt軟件比起傳統(tǒng)流式更簡單，是高通量流式篩選必備儀器。下面讓我們看看iQue® 是如何在iPSC表征中發(fā)揮作用的吧：
 

圖3. 使用 iQue® 高通量流式細(xì)胞儀分析 iPSC 標(biāo)記物表達(dá)的變化。 
iQue Forecyt® 軟件收集的 iPSC 生長數(shù)據(jù)的散點(diǎn)圖，iPSC 分別在優(yōu)化培養(yǎng)基 (mTESR Plus) 和未優(yōu)化培養(yǎng)基 (RPMI) 中培養(yǎng)了 (A) 2 天和 (B) 4 天，誘導(dǎo)“分化”。圖中顯示了 SSEA-1（非多能性標(biāo)記物）、SSEA-4（多能性標(biāo)記物）、TRA-1-60（多能性標(biāo)記物）和“多能性”（SSEA-1 陰性，SSEA-4/TRA-1-60 陽性）的標(biāo)記物表達(dá)量（± SEM，n=4）。圖 (C) 顯示了iQue Forecyt®軟件所呈現(xiàn)的 SSEA-1 和“多能性”標(biāo)記物原始數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集自優(yōu)化和未優(yōu)化條件下生長 2 天的 iPSC (n=4)。NCCIT 和 THP-1 分別是多能性標(biāo)記物表達(dá)和非多能性標(biāo)記物表達(dá)的對(duì)照細(xì)胞系。
   

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使用三種賽多利斯儀器（CellCelector Flex，Incucyte® 和 iQue®）挑取和接種 iPSC、測定多能性并監(jiān)測細(xì)胞生長情況和匯合度。自動(dòng)化、靈活的工作流程讓您的iPSC培養(yǎng)和表征不再困難。