通過對抗Trim28從而驅(qū)動自然殺傷細(xì)胞的成熟和抗腫瘤免疫的機(jī)制介紹

期刊：Nature Communications
影響因子：16.6
伯豪生物技術(shù)：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序

導(dǎo)語
自然殺傷細(xì)胞（NK）細(xì)胞的成熟過程由多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，決定了其功能，但很少有針對這一過程的檢查點被深入研究。在這里，我們發(fā)現(xiàn)NK特異性的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（gp96）缺失導(dǎo)致小鼠NK細(xì)胞成熟度下降。這些gp96缺陷的NK細(xì)胞在刺激時表現(xiàn)出破壞的活化、細(xì)胞毒性和IFN-γ的產(chǎn)生，以及NK細(xì)胞成熟，對IL-15的反應(yīng)減弱。在體內(nèi)，NK特異性gp96缺陷小鼠顯示腫瘤生長增加。在機(jī)制上，我們確定Eomes是下游轉(zhuǎn)錄因子，gp96與Trim28結(jié)合，以防止Trim28介導(dǎo)的Eomes泛素化和降解。因此，我們的研究表明，gp96-Trim28-Eomes軸是小鼠NK細(xì)胞成熟和癌癥監(jiān)測的重要調(diào)控因子。

關(guān)鍵技術(shù)
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序
（技術(shù)服務(wù)由伯豪生物提供）

研究成果
1. NK特異性gp96缺失降低了NK細(xì)胞的成熟和功能
為了研究gp96在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞發(fā)育和功能中的作用，我們制作了Ncr1Cregp96fl/fl小鼠。這些小鼠存在gp96的條件缺失，特別是在NKp46+細(xì)胞中。通過免疫印跡法證實了NK細(xì)胞中g(shù)p96蛋白的缺失（圖1A）。脾臟中未成熟的CD11bCD27-和不成熟的CD11bCD27+ NK細(xì)胞較少，CD27+ CD11b+和CD11b+ CD27-成熟的NK細(xì)胞較少（圖1B）。在骨髓中的NK細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果（圖1C）。此外，gp96缺陷的NK細(xì)胞在蛋白（圖1D）和mRNA（圖1E）水平上表達(dá)成熟標(biāo)志物KLRG1、DX5（Itga2）、NKp46和CD11b降低。

NK特異性gp96敲除小鼠在體內(nèi)比WT小鼠更容易發(fā)生腫瘤發(fā)展，小鼠LLC（Lewis肺癌細(xì)胞）（圖2A）和MC38結(jié)腸癌腫瘤（圖2B）顯著加速生長，以及終點MC38腫瘤體積增加（圖2C）。這些結(jié)果表明，NK特異性gp96缺失促進(jìn)了體內(nèi)腫瘤的生長。此外，與WT小鼠相比，在gp96 KO小鼠的MC38腫瘤中觀察到腫瘤浸潤NK細(xì)胞減少（圖2d-f），這些NK細(xì)胞表達(dá)較低的脫顆粒標(biāo)志物CD107a（圖2G），表明腫瘤浸潤NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能減弱。在腫瘤轉(zhuǎn)移的B16F10黑色素瘤模型中也觀察到類似的結(jié)果。Gp96敲除小鼠表現(xiàn)出更多的黑色素瘤結(jié)節(jié)（圖2H，I），肺中IFN-γ+和CD107a+ NK細(xì)胞的頻率更低（圖2G）。我們進(jìn)一步檢測了gp96缺陷的小鼠NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛能。直接在體外，與WT NK細(xì)胞相比，gp96缺陷的NK細(xì)胞對原型YAC-1靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性降低（圖2K）。此外，體內(nèi)殺傷實驗也表明，來自gp96基因敲除小鼠的NK細(xì)胞的殺傷活性較低（圖2L）。
 

圖2

2. Gp96缺失抑制了NK細(xì)胞對IL-15的反應(yīng)
為了研究gp96介導(dǎo)的NK細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞毒性的潛在機(jī)制，我們開始研究gp96是否調(diào)控NK細(xì)胞對IL-15的反應(yīng)，而IL-15在NK細(xì)胞成熟和效應(yīng)功能中起著關(guān)鍵作用28。gp96缺陷小鼠的骨髓細(xì)胞在IL-15含/不含自洽場的情況下培養(yǎng)。與WT細(xì)胞不同，gp96-/-骨髓細(xì)胞不能有效地發(fā)育成熟的NK細(xì)胞（圖3A）。.另外用不同劑量的IL-15體外刺激WT和gp96 KO小鼠的脾細(xì)胞1周。WT小鼠白細(xì)胞中NK細(xì)胞總數(shù)的頻率略高于gp96 KO小鼠（圖3B），值得注意的是，gp96缺失消除了DX5+IL-15處理成熟NK細(xì)胞的作用，WT- NK細(xì)胞（圖3C）。即使在沒有IL-15的培養(yǎng)7天后，脾細(xì)胞中也檢測到較低比例的NK細(xì)胞（圖3C），這可能是由于脾細(xì)胞刺激了微量的自分泌IL-15和其他細(xì)胞因子。

IL-15通過激活幾個下游信號通路來促進(jìn)NK細(xì)胞的發(fā)育，包括JAK-STAT5和PI3K-ATKmTOR通路9,28。在IL-15刺激下，與WT細(xì)胞相比，gp96缺陷的脾NK細(xì)胞顯示STAT5的磷酸化水平突然下降，而p-S6是mTOR激活的可靠標(biāo)志（圖3d-f）。同樣，在NK92細(xì)胞中，用一種特異性抑制劑抑制gp96也也降低了STAT5和mTOR的激活（圖3G，H）。
 

圖3

3. gp96缺陷的NK細(xì)胞與eomes缺陷的細(xì)胞具有特異性和共享的轉(zhuǎn)錄組特征
分析NK細(xì)胞（7349 WT和8350 Ncr1Cregp96fl/fl NK細(xì)胞），檢測WT中平均1376個基因轉(zhuǎn)錄本，Ncr1Cregp96fl/fl NK細(xì)胞中1368個基因轉(zhuǎn)錄本。對所有已測序的NK細(xì)胞的無監(jiān)督聚類顯示了基于轉(zhuǎn)錄本簽名的6個不同的聚類（圖4A），

每個簇都表達(dá)獨(dú)特的基因標(biāo)記（圖4B）。來自gp96-/-和WT小鼠的NK細(xì)胞表現(xiàn)出不同的簇狀模式(圖4C）。接下來，我們使用RNA速度方法追蹤細(xì)胞命運(yùn)和重建細(xì)胞譜系方向。在WT細(xì)胞中，NK的成熟遵循一個單一的主要分支（簇3/5到2到簇0/1和4），但沒有明顯的分裂。相比之下，速度分析顯示，在gp96敲除條件下，通過簇3到簇4到簇0/1有一個不同的分支（圖4E）。
 

圖4

參考文獻(xiàn)：
Yuxiu Xu, Xin Li, Fang Cheng, Bao Zhao, Min Fang , Zihai Li , Songdong Meng.Heat shock protein gp96 drives natural killer cell maturation and anti-tumor immunity by counteracting Trim28 to stabilize Eomes[J].Nat Commun

. 2024 Feb 6;15(1):1106. doi:10.1038/s41467-024-45426-5.