單細(xì)胞可視化培養(yǎng)系統(tǒng)isoCell近期發(fā)布3篇hiPSC文章解讀

人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (hiPSC) 是通過(guò)基因編輯技術(shù)（如 CRISPR-Cas9）對(duì)已經(jīng)高度分化的人體細(xì)胞進(jìn)行重新逆分化得到的多能干細(xì)胞。傳統(tǒng)的hiPSC細(xì)胞系構(gòu)建與培養(yǎng)過(guò)程操作復(fù)雜、耗材昂貴且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。特別是對(duì)于異質(zhì)編輯細(xì)胞池中構(gòu)建的克隆hiPSC系的培養(yǎng)，受到了傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方法的桎梏，很難構(gòu)建一個(gè)高效的hiPSC構(gòu)建與培養(yǎng)工作流程。此外，現(xiàn)有的單細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法通常對(duì)細(xì)胞的處理?xiàng)l件要求苛刻，操作步驟繁瑣，無(wú)法充分保證單克隆性。

為應(yīng)對(duì)hiPSC細(xì)胞系構(gòu)建與培養(yǎng)過(guò)程中的諸多挑戰(zhàn)，iotaSicences公司采用了以GRID技術(shù)為核心的高度自動(dòng)化的單細(xì)胞可視化培養(yǎng)系統(tǒng)isoCell，構(gòu)建了用于 hiPSC細(xì)胞系培養(yǎng)的平臺(tái)。該平臺(tái)采用全自動(dòng)化流程，操作條件溫和，對(duì)單細(xì)胞無(wú)損傷，具有高通量、自動(dòng)化、高成活率等優(yōu)勢(shì)，可確保分選出的細(xì)胞100%為單細(xì)胞。柏林醫(yī)學(xué)大學(xué)多能干細(xì)胞和類器官研究中心的Harald Stachelscheid團(tuán)隊(duì)使用isoCell在Stem Cell Research期刊上發(fā)表了三篇構(gòu)建不同功能的hiPSC細(xì)胞系的科研應(yīng)用文章，展示了isoCell在hiPSC細(xì)胞系構(gòu)建和培養(yǎng)方面的優(yōu)勢(shì)。
 

圖1 單細(xì)胞可視化培養(yǎng)系統(tǒng)isoCell實(shí)物圖

1. 以isoCell為核心的hiPSC細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)

isoCell系統(tǒng)組成的細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)是基于GRID技術(shù)的高度自動(dòng)化的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。GRID是指在細(xì)胞培養(yǎng)基上采用FC40液體分隔出的網(wǎng)格小室，體積�。ê牟纳伲�，光學(xué)透明度高，可以容納細(xì)胞在內(nèi)生長(zhǎng)，且各個(gè)小室之間物質(zhì)不流通。isoCell系統(tǒng)配備了熒光和成像系統(tǒng)，用于在整個(gè)克隆工作流程中記錄 GRID 小室的圖像（見(jiàn)下圖）。
 

圖2 GRID實(shí)物圖
 

isoCell 可自動(dòng)執(zhí)行所有液體處理步驟，包括構(gòu)建 GRID、將單細(xì)胞注射到GRID小室中以及交換培養(yǎng)基和收獲單克隆集落，在整個(gè)工作流程中自動(dòng)檢測(cè)每一個(gè) GRID 小室，并確保每一個(gè)單克隆hiPSC細(xì)胞系來(lái)源于單個(gè)細(xì)胞。
 

圖3  isoCell操作流程圖

2. 生成具有 SLC16A2:G401R 或 SLC16A2 敲除的 iPSC系

X染色體相關(guān)的AHDS綜合征的發(fā)病特點(diǎn)是由編碼甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MCT8（單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8）的SLC16A2基因突變引起精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育嚴(yán)重受損。

該團(tuán)隊(duì)使用CRISPR/Cas9技術(shù)（靶向 SLC16A2 的外顯子3）將AHDS患者錯(cuò)義變體G401R和新型敲除缺失變體 (F400Sfs*17) 引入男性健康供體的hiPSC系（BIHi001-B）。通過(guò)isoCell培育成功地獲得了SLC16A2基因敲除的hiPSC單克隆細(xì)胞系（BIHi001-B-7）和（BIHi001-B-8），并證明了這些新細(xì)胞系在模擬 MCT8 缺陷對(duì)人類神經(jīng)發(fā)育的影響方面的實(shí)用性。文章以Generation of iPSC lines with SLC16A2:G401R or SLC16A2 knock out為題發(fā)表于Stem Cell Research期刊上。
 

圖4  WB驗(yàn)證SLC16A2 敲除的hiPSC系無(wú)法表達(dá)SLC16A2蛋白

3. 生成 THRB-GS(E125G_G126S) 和 THRB-KO 人類 iPSC 系以研究非典型甲狀腺激素信號(hào)傳導(dǎo)

THRB是一種依賴甲狀腺激素 (TH) 結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核受體。相同的受體也可以介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中信號(hào)通路的激活。目前尚無(wú)法區(qū)分這兩種機(jī)制中的哪一種是造成 TH 生理效應(yīng)的原因。

該團(tuán)隊(duì)結(jié)合基因編輯與isoCell的單細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)，成功建立了一種在 THRB DNA 結(jié)合域中具有兩個(gè)突變 (E125G_G126S) 的hiPSC 細(xì)胞系（BIHi001-B-2/3），該突變消除了THRB的核受體作用，因此可以用該細(xì)胞系專門(mén)研究THRB的信號(hào)通路激活作用。該團(tuán)隊(duì)還生成了 THRB 敲除細(xì)胞系（BIHi001-B-6）以消除所有 THRB 效應(yīng)。通過(guò)比較WT結(jié)果和這兩種細(xì)胞系，將甲狀腺激素的影響歸因于潛在的機(jī)制。文章以Generation of THRB-GS(E125G_G126S) and THRB-KO human iPSC lines to study noncanonical thyroid hormone signalling為題發(fā)表于2024年2月的Stem Cell Research期刊上。
 

圖5  基因測(cè)序驗(yàn)證BIHi001-B-2/3和BIHi001-B-6細(xì)胞系敲除或突變了對(duì)應(yīng)基因

4. 使用 CRISPR-Cas9 生成了兩個(gè) BAX/BAK 雙敲除人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系 (iPSC)

腦缺血損傷很多是由于腦缺血狀態(tài)下細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的。Bcl-2基因相關(guān)的X 蛋白 (BAX) 和BCL2 拮抗因子/殺手1（BAK）是 BCL2 家族的兩個(gè)促凋亡因子，BAX 和BAK是線粒體凋亡的執(zhí)行基因，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

該團(tuán)隊(duì)使用 CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了兩個(gè) BAX/BAK 雙敲除人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞BIHi005-A-17和BIHi250-A-1，并通過(guò)isoCell培養(yǎng)獲得了對(duì)應(yīng)的hiPSC單克隆細(xì)胞系。所得細(xì)胞系核型正常，具有典型的形態(tài)并表達(dá)未分化狀態(tài)的典型標(biāo)記，并通過(guò)基因技術(shù)驗(yàn)證了細(xì)胞系已敲除BAK基因。在后續(xù)的研究中，研究人員就可以將該BAX/BAK 雙敲除的hiPSC細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于腦缺血等細(xì)胞凋亡相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)病機(jī)制與治療干預(yù)機(jī)制研究中。文章以Generation of two human induced pluripotent stem cell lines with BAX and BAK1 double knock-out using CRISPR/Cas9為題發(fā)表于2024年4月的Stem Cell Research期刊上。
 

圖6 通過(guò)基因測(cè)序及WB驗(yàn)證BIHi005-A-17和BIHi250-A-1以敲除BAK與BAX基因
 

5. 結(jié)論

以isoCell構(gòu)建的hiPSC細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)可以對(duì)hiPSC細(xì)胞進(jìn)行全自動(dòng)化且溫和地單細(xì)胞培養(yǎng)。通過(guò)isoCell特有的GRID小室網(wǎng)格技術(shù)與可視化分選相結(jié)合，可以確保每一個(gè)單克隆hiPSC細(xì)胞系均來(lái)自單個(gè)細(xì)胞，且節(jié)省培養(yǎng)耗材。

isoCell的培養(yǎng)條件溫和，在以上案例中協(xié)助科研人員構(gòu)建了多個(gè)基因改造hiPSC單克隆細(xì)胞系，成活率高。

單細(xì)胞可視化培養(yǎng)系統(tǒng)isoCell的優(yōu)勢(shì)：

✔ 全自動(dòng)化流程
✔ 操作條件溫和，對(duì)單細(xì)胞無(wú)損傷
✔ 全培養(yǎng)、分析流程可追蹤
✔ 單細(xì)胞率高達(dá)100%
✔ 單克隆細(xì)胞系構(gòu)建成活率高
✔ 結(jié)構(gòu)緊湊，體積小，節(jié)省耗材

單細(xì)胞可視化分選培養(yǎng)系統(tǒng)-isoCell已在Cell、Advanced Science、Small Methods、Nature Communications等知名期刊發(fā)表多篇文章，如下摘引了近年三篇具有代表性的文獻(xiàn)和大家分享。

• Soitu C, Stovall‐Kurtz N, Deroy C, et al. Jet‐Printing Microfluidic Devices on Demand[J]. Advanced Science, 2020, 7(23): 2001854.

• Gangoso E, Southgate B, Bradley L, et al. Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion[J]. Cell, 2021, 184(9): 2454-2470. e26.

• Deroy C, Nebuloni F, Cook P R, et al. Microfluidics on Standard Petri Dishes for Bioscientists[J]. Small Methods, 2021, 5(11): 2100724.

• Deroy C, Wheeler J H R, Rumianek A N, et al. Reconfigurable microfluidic circuits for isolating and retrieving cells of interest[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2022, 14(22): 25209-25219.

• Oliveira N M, Wheeler J H R, Deroy C, et al. Suicidal chemotaxis in bacteria[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 7608.

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路易莎·埃姆斯，研究科學(xué)家：
The Native Antigen Company（LGC 臨床診斷集團(tuán)旗下公司）
“使用 isoCell 進(jìn)行單細(xì)胞克隆工作從一開(kāi)始就簡(jiǎn)單可靠，并且已無(wú)縫地融入我們的流程中。 該程序?qū)��?xì)胞很溫和，我們看到非常好的存活率，可以篩選大量克隆。 我們收到的客戶服務(wù)是優(yōu)質(zhì)的。”