分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：核酸提�。ù胖榉ǎ┑脑�理及運(yùn)用

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)—核酸提取（磁珠法）
隨著疫情相關(guān)信息的傳播，許多先前不為大眾所知的診斷行業(yè)專(zhuān)業(yè)名詞逐漸變得家喻戶曉，如核酸檢測(cè)、試劑盒、咽拭子、假陰性等等。我們?cè)谶M(jìn)行核酸檢測(cè)的時(shí)候，通常需要在檢測(cè)之前經(jīng)歷核酸提取這一步驟，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是將病毒的核酸從我們采集的樣本當(dāng)中提取出來(lái)，以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
通過(guò)對(duì)磁珠進(jìn)行一定的包被（如硅基、氨基、羧基等），從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的高通量、自動(dòng)化提取，這一技術(shù)產(chǎn)生于20世紀(jì)80年代，已經(jīng)有了成熟的試劑盒并形成為產(chǎn)業(yè)。

核酸提取法基本原理：
首先，磁珠是一類(lèi)特殊的納微米材料，它們的尺寸通常在零點(diǎn)幾微米到幾微米之間，僅為一根頭發(fā)絲直徑的十幾分之一到幾十分之一，肉眼是無(wú)法觀測(cè)到單個(gè)磁珠的。
其次，它們具有超順磁性，在磁場(chǎng)中可以向一側(cè)迅速移動(dòng)，聚集在一起，而去除磁場(chǎng)后又能夠迅速恢復(fù)到分散狀態(tài)。
最后，用于核酸提取的磁珠表面具有特定的性質(zhì)，在某些條件下能夠?qū)⒉《竞怂嵛�附在表面，在另一些條件下又能將病毒核酸從表面釋放下來(lái)，用于后續(xù)的檢測(cè)步驟。核酸結(jié)合到磁珠上主要依靠靜電作用、疏水作用和氫鍵作用。細(xì)胞或組織在裂解液作用下，其中的DNA/RNA被釋放出來(lái)。此時(shí)經(jīng)過(guò)表面修飾的超順磁性氧化硅納米磁珠即與核酸進(jìn)行“特異性結(jié)合”，形成“核酸-磁珠復(fù)合物”。然后在外加磁場(chǎng)的作用下，復(fù)合物即分離出來(lái)。最后經(jīng)過(guò)洗脫液洗去非特異性吸附的雜志、去鹽、純化后，即得到欲提取的核酸物質(zhì)。


傳統(tǒng)核酸提取法和磁珠法比較：

傳統(tǒng)核酸提取法	磁珠法
技術(shù)簡(jiǎn)單	高質(zhì)量、高通量
手工提取	自動(dòng)化流程
操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力	免去了復(fù)雜的人工提取
不適合大量樣品核酸提取	減少酚類(lèi)、氯仿等有機(jī)試劑對(duì)操作人員傷害
不適合臨床分子診斷	極大滿足如今對(duì)核酸提取效率的需求

隨著基因檢測(cè)、個(gè)性化給藥、產(chǎn)前診斷等的普及，在生物行業(yè)各領(lǐng)域都追求高通量、自動(dòng)化的今天，傳統(tǒng)DNA提取方法的局限愈來(lái)愈明顯，而磁珠法DNA提取的優(yōu)勢(shì)則愈來(lái)愈明顯：能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化、大批量操作；操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短；不使用傳統(tǒng)方法中的苯、氯仿等有毒試劑，安全無(wú)毒完全符合現(xiàn)代環(huán)保理念；與核酸的特異性結(jié)合使得提取的核酸純度高、濃度大。

如何評(píng)估磁珠法提取核酸的效果？
這里給出三個(gè)評(píng)價(jià)尺度：
Purity（純度），具體而言就是磁珠提取后的核酸中含有多少非核酸類(lèi)的雜質(zhì)殘留，如蛋白、鹽、多糖等。該指標(biāo)通常用吸光度比值（A260/A280和A260/A230）來(lái)衡量。
Q指的是Quality（質(zhì)量），磁珠提取后的核酸尤其是較長(zhǎng)的基因組核酸應(yīng)保持其完整性，不應(yīng)出現(xiàn)斷裂或降解等現(xiàn)象。該指標(biāo)可通過(guò)簡(jiǎn)單的凝膠電泳或者復(fù)雜一些的特定PCR及微流控芯片（如Agilent Bioanalyzer）進(jìn)行評(píng)估。
R指的是Recovery（收率），磁珠提取過(guò)程應(yīng)當(dāng)盡量將所有的核酸都能從樣本中提取出來(lái)。高收率對(duì)于核酸檢測(cè)尤其是疾病早期檢測(cè)的靈敏度至關(guān)重要，在疾病早期，樣本中的病原體核酸含量通常較低，如果不能高效率地提取到所有核酸，那么很容易出現(xiàn)假陰性，導(dǎo)致漏檢。

磁珠如何與核酸結(jié)合實(shí)現(xiàn)提取功能？
核酸作為一種生物大分子，之所以能夠在水溶液中穩(wěn)定分散不沉淀，是由于三種非共價(jià)作用力的存在：（1）靜電相互作用（2）范德華力（3）氫鍵。核酸分子具有多個(gè)磷酸基團(tuán)，呈現(xiàn)高度負(fù)電性，分子間互相排斥從而避免發(fā)生團(tuán)聚。此外，核酸分子在水溶液中通過(guò)氫鍵與范德華力結(jié)合了大量的水分子在其周?chē)�，形成一個(gè)水化層，也阻止了分子間的聚集。因此，要使得核酸分子結(jié)合到磁珠表面，就必須削弱上述作用力，屏蔽溶液中的靜電斥力，同時(shí)破壞核酸分子表面的水化層，使其能夠與磁珠表面相接觸，進(jìn)而產(chǎn)生吸附。


目前根據(jù)磁珠的表面性質(zhì)，磁珠大致有以下幾類(lèi)：
1. 硅羥基磁珠：
這是一類(lèi)使用最為廣泛的磁珠。使用硅羥基磁珠提取核酸時(shí)，通常需要高濃度的離液鹽（NaI、NaClO4、GuHCl、GuSCN等）。高濃度的鹽離子能夠有效屏蔽溶液中的靜電斥力。同時(shí)，離液鹽離子還能競(jìng)爭(zhēng)性地與磁珠表面以及核酸分子相結(jié)合，破壞二者表面原有的水化層，促進(jìn)磁珠表面與核酸分子的吸附（氫鍵+范德華力）。由于常用的離液鹽如胍基離子對(duì)PCR有抑制作用，因此它們必須在后續(xù)的洗滌步驟中被去除，去除效果可通過(guò)吸光度比值進(jìn)行監(jiān)控。
2. 羧基磁珠：
這類(lèi)磁珠除了能夠像硅羥基磁珠一樣在高濃度離液鹽環(huán)境中結(jié)合核酸分子之外，還能通過(guò)另一種特殊的機(jī)制與核酸分子結(jié)合。通過(guò)向溶液中加入一定濃度的PEG和NaCl，可以使得核酸分子從伸展的構(gòu)象逐漸蜷縮成小球狀，其上的負(fù)電荷也大部分被屏蔽掉，促使核酸分子吸附到磁珠上。核酸分子的分子量越大，越傾向于發(fā)生這種從伸展線團(tuán)向蜷縮小球的構(gòu)象變化，因此，通過(guò)調(diào)節(jié)鹽溶液與核酸樣本的體積比，能夠?qū)崿F(xiàn)較大分子量的核酸片段在羧基磁珠表面的優(yōu)先吸附，達(dá)到所謂的片段篩選效應(yīng)。
3. 氨基/咪唑基等正電荷磁珠：
此類(lèi)磁珠能夠方便地通過(guò)調(diào)節(jié)pH實(shí)現(xiàn)核酸分子在表面的可逆結(jié)合。不過(guò)，由于正電荷表面對(duì)核酸分子吸附過(guò)強(qiáng)，容易導(dǎo)致收率偏低，因此正電荷磁珠的使用反而不如硅羥基及羧基磁珠廣泛。

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