MeRIP-seq等揭示RNA m6A去甲基化酶調(diào)控植物雄性不育的分子機(jī)制
水稻是全球重要的農(nóng)作物，也是單子葉植物模型。在水稻中，N6-甲基腺苷（m6A）mRNA修飾對植物的發(fā)育和脅迫響應(yīng)至關(guān)重要。OsFIP37作為m6A甲基化復(fù)合體的核心組分，其缺乏會導(dǎo)致雄性不育，強(qiáng)調(diào)了m6A在雄性生育中的重要性。m6A是一種可逆的修飾，可以被m6A去甲基化酶去除，但m6A去甲基化酶是否調(diào)控水稻的雄性育性尚未明確。
北京大學(xué)賈桂芳與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院萬建民院士團(tuán)隊(duì)合作研究鑒定出水稻RNA m6A去甲基酶（OsALKBH9），并表明其參與水稻雄性育性調(diào)控。相關(guān)研究成果于2024年4月17日以“OsALKBH9-mediated m6A demethylation regulates tapetal PCD and pollen exine accumulation in rice”為題發(fā)表在《Plant Biotechnology Journal》期刊。
標(biāo)題：OsALKBH9-mediated m6A demethylation regulates tapetal PCD and pollen exine accumulation in rice（OsALKBH9介導(dǎo)的m6A去甲基化調(diào)控水稻絨氈層細(xì)胞死亡和花粉外壁積累）
時間：2024.4.17
期刊：Plant Biotechnology Journal
影響因子：IF 13.8 / 1區(qū)
實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)胞學(xué)分析、轉(zhuǎn)錄組分析、m6A-seq分析等
研究摘要：
本研究鑒定出mRNA m6A去甲基化酶OsALKBH9，并發(fā)現(xiàn)其在參與雄性育性中的調(diào)控。OsALKBH9敲除導(dǎo)致水稻雄性不育，且這種雄性不育依賴于其m6A去甲基化活性。細(xì)胞學(xué)分析揭示了Osalkbh9-1突變體中調(diào)控花藥絨氈層細(xì)胞死亡（Tapetal Programmed Cell Death, PCD）的缺失和花粉外壁（exine）的過度積累�；ㄋ幍霓D(zhuǎn)錄組分析顯示，Osalkbh9-1突變體中與絨氈層發(fā)育、花粉壁合成和轉(zhuǎn)運(yùn)通路相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。此外，研究人員驗(yàn)證了OsALKBH9可以直接去甲基化TDR和GAMYB轉(zhuǎn)錄本中的m6A修飾，影響了這些mRNA穩(wěn)定性，并最終導(dǎo)致花粉外壁的過度積累。本研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了mRNA m6A修飾的精確調(diào)控，并揭示了OsALKBH9介導(dǎo)的m6A去甲基化在水稻絨氈層PCD和花粉外壁積累中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。OsALKBH9的發(fā)現(xiàn)為雜交育種提供了有價值的雄性不育材料，為理解m6A在植物育性中的作用提供了新視角。
研究方法：
結(jié)果圖形
（1）敲除OsALKBH9導(dǎo)致水稻雄性不育，且OsALKBH9在雄性育性中的調(diào)控依賴于其m6A去甲基化酶活性
圖1：OsALKBH9在調(diào)控水稻雄性育性中的作用及其m6A去甲基化活性的重要性
(a) 利用CRISPR/Cas9技術(shù)對OsALKBH9基因進(jìn)行目標(biāo)位點(diǎn)突變。
(b) WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2突變植物抽穗后的表型。
(c) 成熟階段WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2的稻穗比較。
(d) WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2植物的小穗。
(e) 用I2/KI溶液染色的WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2的花粉粒。
(f) 突變體與WT植物雜交的種子設(shè)置率（n=10株植物）。
(g-h) 基因互補(bǔ)植物和去甲基化酶活性缺失互補(bǔ)植物的種子設(shè)置率（g）和I2/KI溶液中的花粉粒（h）（n = 3株植物）。
(i-k) 重組OsALKBH9蛋白在體外去甲基化含m6A的單鏈RNA（ssRNA）和聚腺苷酸+ RNA（poly A+ RNA），n = 3個生物學(xué)重復(fù)。(i) 體外去甲基化活性反應(yīng)消化底物的LC-MS/MS色譜圖。(j, k) 使用ssRNA (j) 和poly A+ RNA (k) 作為底物，在體外去甲基化活性反應(yīng)后的m6A變化。
(l) 通過LC-MS/MS在14天齡的WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2莖中純化的mRNA中確定的m6A相對于腺苷的百分比（m6A/A比率）。n = 3個生物學(xué)重復(fù)。
（2）OsALKBH9是絨氈層PCD和花粉外壁積累所必需
（b） 野生型和Osalkbh9-1花藥從第8~11階段的透射電子顯微照片。
（c） WT和Osalkbh9-1花藥7～11期的TUNEL分析。
E：表皮；En：內(nèi)皮層；T：絨氈層；PMC：花粉母細(xì)胞；MC：減數(shù)分裂細(xì)胞；Msp：小孢子；dMsp：敗育的小孢子；Tds：四分體；Dy：二元細(xì)胞；FL：基座層；Te：外壁。
（3）OsALKBH9在花藥中高表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中
（b） 轉(zhuǎn)化了OsALKBH9啟動子驅(qū)動的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）報告基因的轉(zhuǎn)基因花藥進(jìn)行GUS染色，以可視化OsALKBH9表達(dá)。
（c） 亞細(xì)胞組分和免疫印跡分析。對Osalkbh9-1 OsALKBH9pro:：OsALKBH9CDS-FLAG轉(zhuǎn)化體的總蛋白、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核富集級分的SDS-PAGE。UGPase（細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記）和組蛋白H3（細(xì)胞核標(biāo)記）分別進(jìn)行western blot。
（d） 野生型花藥OsALKBH9轉(zhuǎn)錄本的原位雜交。
（e） OsALKBH9在本氏N.benthamiana葉表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。
（4）OsALKBH9缺失影響與雄性育性和花粉外壁（exine）積累相關(guān)基因表達(dá)
（b） 對第7~8階段和第9~10階段的共上調(diào)和共下調(diào)基因進(jìn)行GO分析。左部分表示共上調(diào)基因，右半部分表示共下調(diào)基因。CC代表細(xì)胞組分（cell component），BP代表生物過程（biological process），MF代表分子功能（molecular function）。
（c） qRT-PCR檢測絨氈層發(fā)育和花粉外壁積累所需的基因。
（5）OsALKBH9基因功能喪失導(dǎo)致水稻轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)m6A修飾高甲基化
(b) 累積分?jǐn)?shù)圖和箱線圖顯示Osalkbh9-1和WT中m6A峰值的log2（富集倍數(shù)）。
(c) meta圖和雷達(dá)圖顯示Osalkbh9-1中鑒定出的m6A高甲基化峰值在指定mRNA片段的分布。
(d) 累積分?jǐn)?shù)圖和箱線圖顯示Osalkbh9-1/WT中高甲基化、未變化甲基化和低甲基化峰值的基因表達(dá)模式。
(e) 對具有高甲基化峰值的基因進(jìn)行GO分析。
(f) 基于前1000個峰值，使用HOMER軟件鑒定了依賴OsALKBH9的motif。
（6）OsALKBH9功能喪失導(dǎo)致TDR和GAMYB轉(zhuǎn)錄本中的m6A高甲基化
圖6：OsALKBH9依賴的m6A去甲基化調(diào)控花粉外壁積累。
（a） TDR和GAMYB的相對m6A值。
（b） m6A-IP-qPCR結(jié)果顯示W(wǎng)T和Osalkbh9-1的第9~10階段花藥中的相對m6A水平。
（c） Osalkbh9-1 OsALKBH9pro:：OsALKBH9CDS FLAG小穗（第7~12階段花藥）中的RIP-qPCR顯示Osalkbh9直接與TDR和GAMYB轉(zhuǎn)錄本結(jié)合。
（d） WT和Osalkbh9-1小穗（花藥第7~12階段）中TDR和GAMYB的mRNA半衰期。
（e） OsALKBH9如何調(diào)控花粉外壁積累的工作模型。在野生型中，OsALKBH9去除TDR和GAMYB轉(zhuǎn)錄本上的m6A，降低其mRNA穩(wěn)定性，確�；ǚ弁獗谶m當(dāng)積累。在Osalkbh9-1突變體中，TDR和GAMYB轉(zhuǎn)錄本中m6A高甲基化，促進(jìn)其mRNA穩(wěn)定性，激活參與花粉外壁積累的基因表達(dá)，導(dǎo)致花粉外壁過度積累和異常的外壁形態(tài)。
參考文獻(xiàn)：
Tang J, Lei D, Yang J, Chen S, Wang X, Huang X, Zhang S, Cai Z, Zhu S, Wan J, Jia G. OsALKBH9-mediated mA demethylation regulates tapetal PCD and pollen exine accumulation in rice. Plant Biotechnol J. 2024 Apr 17. doi: 10.1111/pbi.14354. Epub ahead of print. PMID: 38634166.
北京大學(xué)賈桂芳與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院萬建民院士團(tuán)隊(duì)合作研究鑒定出水稻RNA m6A去甲基酶（OsALKBH9），并表明其參與水稻雄性育性調(diào)控。相關(guān)研究成果于2024年4月17日以“OsALKBH9-mediated m6A demethylation regulates tapetal PCD and pollen exine accumulation in rice”為題發(fā)表在《Plant Biotechnology Journal》期刊。
標(biāo)題：OsALKBH9-mediated m6A demethylation regulates tapetal PCD and pollen exine accumulation in rice（OsALKBH9介導(dǎo)的m6A去甲基化調(diào)控水稻絨氈層細(xì)胞死亡和花粉外壁積累）
時間：2024.4.17
期刊：Plant Biotechnology Journal
影響因子：IF 13.8 / 1區(qū)
實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)胞學(xué)分析、轉(zhuǎn)錄組分析、m6A-seq分析等
研究摘要：
本研究鑒定出mRNA m6A去甲基化酶OsALKBH9，并發(fā)現(xiàn)其在參與雄性育性中的調(diào)控。OsALKBH9敲除導(dǎo)致水稻雄性不育，且這種雄性不育依賴于其m6A去甲基化活性。細(xì)胞學(xué)分析揭示了Osalkbh9-1突變體中調(diào)控花藥絨氈層細(xì)胞死亡（Tapetal Programmed Cell Death, PCD）的缺失和花粉外壁（exine）的過度積累�；ㄋ幍霓D(zhuǎn)錄組分析顯示，Osalkbh9-1突變體中與絨氈層發(fā)育、花粉壁合成和轉(zhuǎn)運(yùn)通路相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。此外，研究人員驗(yàn)證了OsALKBH9可以直接去甲基化TDR和GAMYB轉(zhuǎn)錄本中的m6A修飾，影響了這些mRNA穩(wěn)定性，并最終導(dǎo)致花粉外壁的過度積累。本研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了mRNA m6A修飾的精確調(diào)控，并揭示了OsALKBH9介導(dǎo)的m6A去甲基化在水稻絨氈層PCD和花粉外壁積累中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。OsALKBH9的發(fā)現(xiàn)為雜交育種提供了有價值的雄性不育材料，為理解m6A在植物育性中的作用提供了新視角。
研究方法：
- 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在水稻品種Nipponbare中敲除OsALKBH9基因。
- 通過細(xì)胞學(xué)分析、轉(zhuǎn)錄組分析、m6A-seq分析等方法研究OsALKBH9的功能和作用機(jī)制。
- 利用體外去甲基化實(shí)驗(yàn)和m6A-IP-qPCR等技術(shù)驗(yàn)證OsALKBH9的去甲基化活性。
結(jié)果圖形
（1）敲除OsALKBH9導(dǎo)致水稻雄性不育，且OsALKBH9在雄性育性中的調(diào)控依賴于其m6A去甲基化酶活性
圖1：OsALKBH9在調(diào)控水稻雄性育性中的作用及其m6A去甲基化活性的重要性
(b) WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2突變植物抽穗后的表型。
(c) 成熟階段WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2的稻穗比較。
(d) WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2植物的小穗。
(e) 用I2/KI溶液染色的WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2的花粉粒。
(f) 突變體與WT植物雜交的種子設(shè)置率（n=10株植物）。
(g-h) 基因互補(bǔ)植物和去甲基化酶活性缺失互補(bǔ)植物的種子設(shè)置率（g）和I2/KI溶液中的花粉粒（h）（n = 3株植物）。
(i-k) 重組OsALKBH9蛋白在體外去甲基化含m6A的單鏈RNA（ssRNA）和聚腺苷酸+ RNA（poly A+ RNA），n = 3個生物學(xué)重復(fù)。(i) 體外去甲基化活性反應(yīng)消化底物的LC-MS/MS色譜圖。(j, k) 使用ssRNA (j) 和poly A+ RNA (k) 作為底物，在體外去甲基化活性反應(yīng)后的m6A變化。
(l) 通過LC-MS/MS在14天齡的WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2莖中純化的mRNA中確定的m6A相對于腺苷的百分比（m6A/A比率）。n = 3個生物學(xué)重復(fù)。
（2）OsALKBH9是絨氈層PCD和花粉外壁積累所必需
圖2：OsALKBH9敲除導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞降解延遲和花粉壁形態(tài)異常。
（a） 野生型和Osalkbh9-1突變體在花藥發(fā)育階段的7~11期的半薄切片。（b） 野生型和Osalkbh9-1花藥從第8~11階段的透射電子顯微照片。
（c） WT和Osalkbh9-1花藥7～11期的TUNEL分析。
E：表皮；En：內(nèi)皮層；T：絨氈層；PMC：花粉母細(xì)胞；MC：減數(shù)分裂細(xì)胞；Msp：小孢子；dMsp：敗育的小孢子；Tds：四分體；Dy：二元細(xì)胞；FL：基座層；Te：外壁。
（3）OsALKBH9在花藥中高表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中
圖3：OsALKBH9在花藥中高表達(dá)，且主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。
（a） 通過qRT-PCR分析OsALKBH9在不同組織中的表達(dá)。在發(fā)育階段6~12收集花藥。其他組織在開花階段的植物中收獲。（b） 轉(zhuǎn)化了OsALKBH9啟動子驅(qū)動的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）報告基因的轉(zhuǎn)基因花藥進(jìn)行GUS染色，以可視化OsALKBH9表達(dá)。
（c） 亞細(xì)胞組分和免疫印跡分析。對Osalkbh9-1 OsALKBH9pro:：OsALKBH9CDS-FLAG轉(zhuǎn)化體的總蛋白、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核富集級分的SDS-PAGE。UGPase（細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記）和組蛋白H3（細(xì)胞核標(biāo)記）分別進(jìn)行western blot。
（d） 野生型花藥OsALKBH9轉(zhuǎn)錄本的原位雜交。
（e） OsALKBH9在本氏N.benthamiana葉表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。
（4）OsALKBH9缺失影響與雄性育性和花粉外壁（exine）積累相關(guān)基因表達(dá)
圖4：OsALKBH9對雄性育性和花粉外壁積累相關(guān)基因表達(dá)。
（a） Osalkbh9-1突變體與野生型（WT）在花藥發(fā)育7~8階段和9~10階段的基因表達(dá)差異。通過維恩圖展示兩個階段共有和特有的差異表達(dá)基因。（b） 對第7~8階段和第9~10階段的共上調(diào)和共下調(diào)基因進(jìn)行GO分析。左部分表示共上調(diào)基因，右半部分表示共下調(diào)基因。CC代表細(xì)胞組分（cell component），BP代表生物過程（biological process），MF代表分子功能（molecular function）。
（c） qRT-PCR檢測絨氈層發(fā)育和花粉外壁積累所需的基因。
（5）OsALKBH9基因功能喪失導(dǎo)致水稻轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)m6A修飾高甲基化
圖5：OsALKBH9基因功能喪失導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A高甲基化。
(a) 火山圖結(jié)果顯示了Osalkbh9-1與野生型（WT）之間m6A修飾變化。(b) 累積分?jǐn)?shù)圖和箱線圖顯示Osalkbh9-1和WT中m6A峰值的log2（富集倍數(shù)）。
(c) meta圖和雷達(dá)圖顯示Osalkbh9-1中鑒定出的m6A高甲基化峰值在指定mRNA片段的分布。
(d) 累積分?jǐn)?shù)圖和箱線圖顯示Osalkbh9-1/WT中高甲基化、未變化甲基化和低甲基化峰值的基因表達(dá)模式。
(e) 對具有高甲基化峰值的基因進(jìn)行GO分析。
(f) 基于前1000個峰值，使用HOMER軟件鑒定了依賴OsALKBH9的motif。
（6）OsALKBH9功能喪失導(dǎo)致TDR和GAMYB轉(zhuǎn)錄本中的m6A高甲基化
圖6：OsALKBH9依賴的m6A去甲基化調(diào)控花粉外壁積累。
（b） m6A-IP-qPCR結(jié)果顯示W(wǎng)T和Osalkbh9-1的第9~10階段花藥中的相對m6A水平。
（c） Osalkbh9-1 OsALKBH9pro:：OsALKBH9CDS FLAG小穗（第7~12階段花藥）中的RIP-qPCR顯示Osalkbh9直接與TDR和GAMYB轉(zhuǎn)錄本結(jié)合。
（d） WT和Osalkbh9-1小穗（花藥第7~12階段）中TDR和GAMYB的mRNA半衰期。
（e） OsALKBH9如何調(diào)控花粉外壁積累的工作模型。在野生型中，OsALKBH9去除TDR和GAMYB轉(zhuǎn)錄本上的m6A，降低其mRNA穩(wěn)定性，確�；ǚ弁獗谶m當(dāng)積累。在Osalkbh9-1突變體中，TDR和GAMYB轉(zhuǎn)錄本中m6A高甲基化，促進(jìn)其mRNA穩(wěn)定性，激活參與花粉外壁積累的基因表達(dá)，導(dǎo)致花粉外壁過度積累和異常的外壁形態(tài)。
參考文獻(xiàn)：
Tang J, Lei D, Yang J, Chen S, Wang X, Huang X, Zhang S, Cai Z, Zhu S, Wan J, Jia G. OsALKBH9-mediated mA demethylation regulates tapetal PCD and pollen exine accumulation in rice. Plant Biotechnol J. 2024 Apr 17. doi: 10.1111/pbi.14354. Epub ahead of print. PMID: 38634166.
標(biāo)簽：
RNA甲基化
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