層析過程中色素的產(chǎn)生原因及對應去除方法

溶液外觀對注射用的原料來說是必檢項目，其通常包括液體的透明度、濁度和顏色。在生物制劑制造過程中，由于培養(yǎng)基及金屬工藝設備的接觸，使得色素存在于蛋白質中間體和最終樣品原液中，這在高濃度蛋白溶液中尤為顯著。

蛋白溶液的外觀在產(chǎn)品放行檢測時是一個重要的質量參數(shù)�！稓W洲藥典》對人用單克隆抗體顏色做出了要求，即人用單克隆抗體的液體制劑是“透明或略帶乳白色，無色或略帶顏色的液體”^[1]。這也是國際人用藥品注冊技術協(xié)調會(ICH) Q6B放行規(guī)范中規(guī)定的檢測項。顏色異常意味著產(chǎn)品可能被污染或已降解，所以色素的控制和去除是蛋白生產(chǎn)過程中非常重要的環(huán)節(jié)。提前了解色素的控制和去除方法對于新藥或仿制藥的質量標準起草和申報都非常有幫助。

色素的來源
影響蛋白溶液顏色且難以去除的色素主要是由培養(yǎng)基組分在培養(yǎng)和收獲過程中與蛋白分子結合或導致蛋白分子變性時產(chǎn)生的。對顏色影響最大的是維生素B和鐵離子，比如哺乳動物細胞培養(yǎng)基中的常添加的CN-B12在光照條件下轉化為OH-B12之后與抗體分子結合導致粉色^[2]；鐵離子濃度會增加蛋白藥物原液的顏色和酸性變異體。
鐵離子不會直接引起蛋白原液的變化，會因芬頓反應產(chǎn)生活性氧（ROS），使蛋白質發(fā)生氧化，導致蛋白質中的色氨酸氧化成N-甲酰犬尿氨酸(淺黃色)和犬尿氨酸(棕黃色)^[3,5]。
細胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的幾種高級糖化終產(chǎn)物(AGE)是有顏色(黃褐色)和熒光的。AGE的結構及其形成途徑復雜多樣，但都源于還原糖或碳水化合物氧化降解的二羰基副產(chǎn)物與蛋白質賴氨酸或精氨酸的氨基側鏈反應[3]。
畢赤酵母誘導中后期，AOX1醇氧化酶釋放進入發(fā)酵液，結合黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 輔因子形成八聚物導致綠色^[4]。
另外，天然互作蛋白以及小分子色素等，也可能會引入顏色。

蛋白溶液顏色的控制
在蛋白生產(chǎn)過程中，細胞株構建、上游培養(yǎng)、層析純化這三個階段都能對色素進行有效的控制和去除。尤其在純化階段，層析介質可以有效去除樣品中的多種色素。

細胞株構建階段
不同的細胞株對鐵離子和維生素B12的吸收和需求量有所不同，如果選擇對鐵離子和維生素B12消耗速率快或含量要求低的細胞株，使其培養(yǎng)液中的鐵離子和維生素B12含量降低，產(chǎn)生異常顏色的概率會降低。

上游培養(yǎng)階段
適當優(yōu)化培養(yǎng)基的組分，比如抗體生產(chǎn)中可以適當調整培養(yǎng)基中的高氧化性組分（如鐵離子）和光敏感性成分（如B族維生素等）的含量。

在細胞培養(yǎng)工藝開發(fā)中，通過優(yōu)化金屬離子或者其它添加劑的含量，可能會導致蛋白顯色，建議嘗試不同類型的培養(yǎng)基，適當減少這些成分的用量，并通過篩選高產(chǎn)細胞株或長期傳代馴化，保證產(chǎn)量。

層析純化階段
色素的種類特別多，大分子、小分子的，帶正、負電荷的，疏水、親水的等。層析純化適用于去除一些與蛋白質不結合或者非共價結合的色素去除，對于一些與蛋白共價結合的色素（如OH-B12與半胱氨酸殘基的結合），則需要優(yōu)化培養(yǎng)條件，在上游培養(yǎng)階段進行控制。如果不清楚溶液中色素的性質，可以嘗試不同的層析方法。

• 親和層析
親和層析多為蛋白純化捕獲階段，通過優(yōu)化緩沖液體系以破壞色素與填料之間的離子型吸附及非特異性吸附，在對蛋白進行富集的同時可有效去除色素。
• 離子交換層析
中性條件下多數(shù)色素帶負電荷，陰離子流穿模式時色素與填料結合，通過高鹽或堿液洗脫�；虻鞍捉Y合陽離子填料，色素流穿。該階段的重點在于溶液的pH值與離子強度，找到合適的上樣條件是去除色素的關鍵。
• 疏水作用層析
色素也具有一定的疏水性質，因此可以利用色素與目的蛋白表面疏水性的差異，通過優(yōu)化填料的種類、鹽的類型和濃度、選擇不同的鹽濃度梯度洗脫的方式來去除色素。
• 凝膠過濾層析
如果色素與目的蛋白分子量上有明顯差異，可使用凝膠過濾進行去除，例如通過脫鹽柱進行緩沖液置換及精純階段高分辨分子篩除雜時，色素在一定程度上可被去除或被吸附。

案例分享：動物源體外分泌酶中色素的去除
本案例使用Diamond MMC Mustang填料通過DoE方法開發(fā)出的動物源體外分泌酶的純化工藝，可以很好地將料液中的黃色色素去除掉。從下圖中可以明顯看出，洗脫液基本接近無色，色素去除效果很好。

左：原樣；中：清洗液；右：洗脫液

Diamond MMC Mustang填料是一款高剛性的弱陽離子+疏水的復合模式填料，由于兼具離子、疏水、氫鍵、范德華力等多種作用力，使其對多種類型的色素都有較好的去除效果。

層析介質上色素的去除
色素性質復雜，可根據(jù)填料的耐受情況制定CIP方案。NaOH是最常用的清潔試劑。除此之外，高鹽、有機試劑（20%乙醇或30%異丙醇）、尿素、鹽酸胍或酸也是常見的清洗方案。也可通過混合試劑或其他針對性清洗方法對填料進行處理，如已知色素種類，可根據(jù)色素的性質采用特定的方法進行清洗。

鐵離子殘留帶來的黃褐色去除
黃褐色主要源于鐵離子與NaOH反應生成的氫氧化鐵沉淀，可以嘗試使用酸進行清洗，例如使用0.5M磷酸靜態(tài)處理10~15min。處理時間不宜過長，時間過長可能會導致鐵離子重新結合^[5]。
維生素B12引起的粉色去除
可以使用組氨酸或咪唑等電子供體取代OH-B12中的OH自由基，例如使用0.3M組氨酸+0.5M NaCl，pH4.0的緩沖液處理5~10CV。
疏水作用力結合的色素去除
使用高濃度的堿溶液破壞蛋白結構，破壞疏水作用力，例如使用0.5~1M NaOH處理3~5CV。
脂類色素
根據(jù)相似相溶原理可以用0.5M 非離子去污劑、70%乙醇、30%異丙醇處理3~5CV。
沉積的頑固色素
可以采用多種試劑混合進行處理，例如使用0.5M醋酸+8M尿素+1~2M NaCl或1M NaOH+2M NaCl處理5~10CV。在可以耐受有機溶劑時，還可使用1M NaOH+30%異丙醇的方式進行清洗。
隨著介質使用次數(shù)的增加，積累的色素仍可能會導致填料外觀顏色變深、載量下降，嚴重時柱內(nèi)填料塌陷、板結，影響填料性能與壽命，必要時可以去掉部分色素污染嚴重的填料。

總結
色素的種類多樣，雖然層析純化是去除色素最有效的方法之一，但是填料的性能也受色素影響，因此對料液預處理階段的過濾與澄清，可以很大程度上緩解后續(xù)純化的壓力、延長填料的使用壽命。

參考資料
[1] European Pharmacopoeia, Council of Europe, Strasbourg,France, Edition 7.5; 2012.
[2] Kenneth M Prentice, et al. Hydroxocobalamin association during cell culture results in pink therapeutic proteins [J]. mAbs, 5:6, 974-981, 2013.
[3] Margaret Butko, et al. Recombinant Antibody Color Resulting from Advanced Glycation End Product Modifications [J]. Analytical Chemistry, 86(19): 9816-9823, 2014.
[4] L. M. Damasceno, et al. An optimized fermentation process for high-level production of a single-chain Fv antibody fragment in Pichia pastoris [J]. Protein Expression and Purification, 37:18-26, 2004.
[5] 翁志兵,王鵬紅,趙力,等.層析填料中頑固色素去除的新方法研究[J].食品與生物技術學報,2022,41(02):106-111.