DNA雙鏈斷裂修復能力快速評估技術詳解

     InnoScan文獻快訊—
     DNA雙鏈斷裂修復能力快速評估技術 NEXT-SPOT      


       DNA 雙鏈斷裂 (DSB) 被認為是最有害的 DNA 損傷類型，是突變和染色體畸變的有效誘導物，可能導致遺傳性疾病和癌癥。 為了維持基因組穩(wěn)定，人類細胞需要通過觸發(fā)高度復雜的分子反應信號網(wǎng)絡（以多種修復途徑為特征）來快速啟動和調節(jié) DSB 修復。
       首先，非同源末端連接（NHEJ）途徑可在整個細胞周期中保持活躍，直接結合兩個斷裂末端，而不需要參考任何模板。 由于這些原因，它被認為是所有類型 DSB 的主要修復機制。 相比之下，同源重組 (HR) 被認為是無錯誤的途徑，也是在細胞周期 G2/S 期（此時有模板材料可用）處理 DSB 的最佳選擇。 同源重組首先切除 DNA 末端，形成侵入同源 DNA 區(qū)域的單鏈區(qū)域。 然后，幾個競爭途徑完成同源重組過程，并涉及 DNA 合成。 單鏈退火 (SSA) 有時被描述為同源重組的子途徑，因為它依賴于同源重組相關機制及其對同源性的依賴，它也涉及遺傳物質的刪除，被認為具有誘變性。
      當非同源末端連接禁用時，另一種末端連接途徑（alt-EJ，也稱為微同源介導的末端連接）起作用。 它以一種容易出錯的方式連接兩個 DNA 末端，因為它通常意味著修復序列的微缺失。 不僅 HR，alt-EJ 和 SSA 都需要切除 DNA 末端以生成不同大小的單鏈 DNA (ssDNA) 尾部。 ssDNA 尾部的長度影響修復機制的選擇， alt-EJ  2-20 bp，SSA 超過 50 bp，HR 大約 100 bp。 DNA 聚合酶在 DSB 修復中發(fā)揮重要作用，因為它們可以填補空缺以促進 DNA 鏈連接或添加核苷酸以產生同源性。
      評估細胞DNA雙鏈斷裂修復能力對于了解疾病侵襲和治療反應至關重要。傳統(tǒng)評估方法通常耗時且復雜。為解決該挑戰(zhàn)，研究人員開發(fā)了NEXT-SPOT技術。 NEXT-SPOT技術在DNA修復評估領域具有幾個關鍵優(yōu)勢。它提供了一種快速而高效的DSB修復能力評估方法，使研究人員能夠在不到2小時內獲得關于修復途徑的定性和定量信息。通過表征HR-like鏈侵入、DNA末端連接和合成活性，NEXT-SPOT提供了對細胞修復機制的全面分析。該技術能夠檢測細胞在暴露于DNA損傷誘導劑和抑制劑后修復活性的變化，使其成為預測治療結果和指導個性化治療的寶貴工具。  
圖 1. 生物芯片上的 NEXT-SPOT 檢測原理概述。 每個生物芯片由14個 反應區(qū)組成，每反應區(qū)含兩種固定在芯片的底物，超螺旋質粒（SC-質粒）和線性質粒（Lin-質粒），每種底物各兩個點位。 修復反應發(fā)生在固定底物和 Cy3 標記的線性質粒 (Cy3-Lin-plasmid)、生物素-dCTP 和添加的細胞裂解物之間。 然后，生物素標記的 dCTP 通過 Cy5-鏈霉親和素顯示 或者使用 Cy5-dCTP 直標。 使用InnoScan710AL 雙色激光熒光掃描儀（激發(fā)波長：532 和 635 nm）對信號進行量化。 SC-質粒、Lin-質粒、Syn-SC ：SC-質粒上的DNA合成、Syn-Li：Lin-質粒上的DNA合成。
 
NEXT-SPOT實驗生物芯片制備過程包括以下步驟。
 
1.     制備超螺旋質粒（SC-plasmid）和線性質粒（Lin-plasmid）。
 
超螺旋 pBlueScript 質粒（SC-質粒；Stratagene）的制備如 Millau 等人所述（Millau, J.-F. et al. A microarray to measure repair of damaged plasmids by cell lysates. Lab Chip 8, 1713 (2008）。 線性質粒（Lin-質粒）是通過按照制造商方案（New England Biolabs）使用限制性內切酶AflIII消化pBlueScript質粒獲得。 用異丙醇/乙酸鈉沉淀 Lin-質粒，并以所需濃度重懸于分子生物級水中。
Cy3 標記的 線性質粒 (Cy3-Lin-質粒) 是使用 Label IT® Tracker™ 試劑盒 (Mirus) 按照供應商的說明獲得。 簡而言之，將 100 µg 線性質粒與 50 µL Label IT® Reagent 和 100 µL 標記緩沖液在 37 °C 下孵育 2 小時。 然后，Cy3-Lin-質粒在乙醇/氯化鈉中沉淀，用分子生物級水稀釋并儲存在- 80°C。
使用 NanoDrop™ 分光光度計對 Cy3-Lin-質粒進行定量； 標記率是根據(jù)制造商的說明計算。 據(jù)估計，平均每 200 個堿基對約有一個標簽。
 
2.     制作載玻片芯片：
 
使用生物芯片點樣系統(tǒng)（SciFlexarrayer，Scienion 德國）將 SC-質粒和 Lin-質粒點制在涂層載玻片（Nexterion® H，Schott）特定位置。 形成 14 個相同反應區(qū)，每個反應區(qū)含 4 個未標記質粒的點（2 個 SC 質粒和 2 個 Lin 質粒）。 按照載玻片制造商描述的過程進行質粒固定和片基滅活。 將載玻片芯片真空 - 20 °C儲存。
 
 
3.     制備反應室：
使用HybriWell™ Sealing System在生物芯片上形成14個相同的反應室。
每個反應室將用于進行修復反應，評估細胞裂解液中修復蛋白與固定質粒的相互作用。
 
 
4.     修復反應
使用 NEXT‑SPOT 進行 DSB 修復分析。 HybriWell™ 密封系統(tǒng)（Grace Bio-Labs）應用于載玻片芯片上，形成 14 個相同的反應室。 每種裂解物均在 2 種不同的終蛋白質濃度下進行測試。 為此，混合物含有 (i) 2 ng/μL Cy3 標記的線性 DSB 質粒 (Cy3-Lin-plas-mid)、(ii) 0.25 µM 生物素-dCTP、0.25 µM 其他 3 種非標記 dNTP , (iii) 80 mM KCl、20 mM Tris–HCl pH 7.5、10 mM MgCl2、2 mM DTT、0.1 mg/mL BSA、1 mM ATP、0.05 mg/mL 肌酸磷酸激酶、10 mM 磷酸肌酸，總反應體積為 每孔 12 µL。 修復反應在30℃下進行1小時。 然后用 Milli-Q 水潤洗載玻片兩次。 隨后通過與 0.1 µg/mL 鏈霉親和素-Cy5 溶液在 30 °C 下孵育 30 分鐘來標記生物素-dCTP。 用 Milli-Q 水潤洗載玻片兩次并干燥。 每個樣品在兩個反應區(qū)進行測試（技術重復）。 或者，使用 Cy5-dCTP 直接標記，而不使用生物素-dCTP。
 
5.     信號檢測和分析
 
使用掃描儀（Innopsys 的 Innoscan 710AL 和 Mapix 軟件）以 532 nm (Cy3) 和 635 nm (Cy5)為激發(fā)光對熒光信號進行量化。結果以 4 個重復的熒光強度平均值計算。每個樣品均由 4 個值表征，分別為 HR 樣鏈侵入、NHEJ 介導的末端連接、SC 質粒上的 DNA 合成 (Syn-SC) 和 Lin 質粒上的 DNA 合成 (Syn-Lin)。
 

      NEXT-SPOT技術代表了DNA修復能力評估領域的重大進展。通過將創(chuàng)新的生物芯片技術與激光熒光掃描相結合，NEXT-SPOT提供了一種快速、可靠和全面的方法，用于評估DSB修復途徑。該技術提供詳細的細胞修復機制見解，有望促進個性化醫(yī)學，并在腫瘤學領域和其他領域改善患者預后。
 

文獻原文鏈接： https://doi.org/10.1038/s41598-022-23819-0