單細(xì)胞分析助力繪制人類癌癥中腫瘤浸潤(rùn)B細(xì)胞的藍(lán)圖

近日，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院樊嘉院士、高強(qiáng)教授、中國(guó)科學(xué)院上海免疫與感染研究所張曉明研究員、浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院郭國(guó)驥教授團(tuán)隊(duì)合作，在《Science》 期刊發(fā)表了題為“A blueprint for tumor-infiltrating B cells across human cancers ”的研究論文。該研究結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、 單細(xì)胞BCR和單細(xì)胞ATAC的多組學(xué)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)性刻畫了腫瘤浸潤(rùn)性B細(xì)胞的異質(zhì)性、動(dòng)態(tài)分化和表觀調(diào)控機(jī)制。創(chuàng)新地揭示了腫瘤微環(huán)境中廣泛存在的EF應(yīng)答的癌種偏好性、空間定位特征、臨床意義及潛在的誘導(dǎo)調(diào)控機(jī)制。該研究由上海生物芯片有限公司（生物芯片上海國(guó)家工程研究中心）提供部分支持。

在腫瘤免疫過程中，腫瘤浸潤(rùn)性B細(xì)胞在腫瘤免疫過程中扮演著重要的角色。這些B細(xì)胞表現(xiàn)出多種功能，主要是通過它們分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力，但在不同的癌癥類型中，它們?cè)跁r(shí)空上存在差異。解剖不同癌癥類型中B細(xì)胞的豐度和分化狀態(tài)有望改善免疫治療反應(yīng)。為了構(gòu)建全面的腫瘤B細(xì)胞景觀，該團(tuán)隊(duì)研究人員對(duì) 20 種癌癥類型（477個(gè)樣本，269例患者）的 B 細(xì)胞進(jìn)行了全面的單細(xì)胞多組學(xué)分析，將腫瘤浸潤(rùn) B 細(xì)胞反應(yīng)分為生發(fā)中心 （GC） 樣和濾泡外（EF），具有癌癥類型偏好。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EF B細(xì)胞反應(yīng)與免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（TME）和不良預(yù)后有關(guān)。相反，GC樣B細(xì)胞反應(yīng)與抗腫瘤免疫和良好的結(jié)果有關(guān)。

01 文章詳情

文章題目：A blueprint for tumor-infiltrating B cells across human cancers
中文題目：人類癌癥中腫瘤浸潤(rùn)B細(xì)胞的藍(lán)圖
發(fā)表時(shí)間：2024.05
期刊名稱：Science
影響因子：56.9
實(shí)驗(yàn)技術(shù)：scRNA-seq、scBCR-seq、snATAC-seq、mIHC、代謝組、轉(zhuǎn)錄組、Bulk ATAC
DOI：10.1126/science.adj4857

02 文章整體思路

03 研究?jī)?nèi)容

1、跨越人類癌癥的單個(gè)B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組藍(lán)圖
B細(xì)胞浸潤(rùn)在不同類型的人類癌癥中差異很大，文章首先基于癌癥基因組圖譜(TCGA) Pan-Cancer數(shù)據(jù)集(n = 8863，31種癌癥) 評(píng)估了多種腫瘤的B細(xì)胞浸潤(rùn)特征。隨后進(jìn)一步選擇具有高和中等腫瘤內(nèi)B細(xì)胞評(píng)分的癌癥類型進(jìn)行采樣，從15種人類癌癥類型的66例患者的153個(gè)樣本中富集分選CD19+ B細(xì)胞，包括配對(duì)的腫瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(LN_Mets)、鄰近的正常組織和外周血，進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)和單細(xì)胞B細(xì)胞受體測(cè)序(scBCR-seq)。結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)最終建立了來自20種癌癥類型的269個(gè)供體的477個(gè)樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜（圖1A）。共獲得了474,718個(gè)B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，其中69.24%為本研究中新生成的。單細(xì)胞圖譜為B細(xì)胞研究創(chuàng)建了一個(gè)泛癌藍(lán)圖(http://pancancer.cn/B/)。

2、B細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄多樣性
非監(jiān)督降維聚類分析確定了15種不同的B細(xì)胞亞群，這些亞群在不同的癌癥類型均有存在，并表現(xiàn)出不同的組織和癌癥類型偏好（圖1B）。其中，鑒定出代表不同B細(xì)胞成熟階段的典型B細(xì)胞亞群，包括1個(gè)naïve B細(xì)胞群， 3個(gè)activated B細(xì)胞群（(ACBs;CD69和CD83)）， 1個(gè)memory B細(xì)胞群， 3個(gè)GC B細(xì)胞群（LMO2+Light Zone (LZ)， CXCR4+Dark Zone (DZ)和MKI67+cycling）， 2個(gè)ASCs(TXNDC5+PBs和MZB1+ PCs)(圖1C)。除此之外又鑒定出了4種新的亞群(圖C)：（1）干擾素刺激基因陽性naïve B細(xì)胞亞群(B_02)，其高度表達(dá)IFIT3、IFI44L和ISG15，與損傷相關(guān)；（2）應(yīng)激B細(xì)胞(B_03)，在腫瘤中占主導(dǎo)地位，位于TLSs中心，高表達(dá)缺氧相關(guān)基因；（3）GC前體B細(xì)胞(B_10)，在淋巴結(jié)和腫瘤中富集，一種過渡態(tài)B細(xì)胞；（4）AtM B細(xì)胞亞群(B_09)，該亞群廣泛存在于TME中，高度表達(dá)應(yīng)激相關(guān)基因、干擾素誘導(dǎo)基因和激活相關(guān)基因。新鑒定出的4種B細(xì)胞亞群表現(xiàn)出了各自獨(dú)特的功能特征。

3、腫瘤浸潤(rùn)性抗體分泌細(xì)胞（ASCs）的異質(zhì)性
ASCs是通過產(chǎn)生抗體來執(zhí)行效應(yīng)功能的終末分化B細(xì)胞。本次高分辨圖譜顯示腫瘤浸潤(rùn)的ASCs在組織分布、癌癥類型偏好、BCR庫(kù)和轉(zhuǎn)錄組譜方面表現(xiàn)出多方面的多樣性。
結(jié)合scBCR結(jié)果顯示ASCs的比例變化很大，腫瘤浸潤(rùn)的ASCs比鄰近正常組織和血液中的ASCs具有更高的多樣性(P < 0.01)，而非ASCs的多樣性在淋巴結(jié)中最高。15個(gè)B細(xì)胞亞群中，2個(gè)ASC亞群表現(xiàn)出最高的基因表達(dá)異質(zhì)性。對(duì)ASC進(jìn)行非監(jiān)督降維聚類分析發(fā)現(xiàn)10個(gè)不同的PC亞簇具有特定的基因特征和組織分布(圖2A和2B)。這些發(fā)現(xiàn)可能有助于解釋PC在患者預(yù)后中的有爭(zhēng)議的作用，這可能歸因于不同PC亞群和癌癥類型的可變性�？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明不同癌癥類型對(duì)ASCs的浸潤(rùn)有相當(dāng)大的影響，也意味著ASCs的B細(xì)胞起源不同。

4、濾泡外（EF）路徑和生發(fā)中心（GC）路徑被癌癥劫持
之前有研究表明源自GC或EF應(yīng)答的B細(xì)胞通路在自身免疫性疾病和慢性感染中都被觀察到，但腫瘤生態(tài)系統(tǒng)影響不同B細(xì)胞進(jìn)化軌跡的潛力尚未得到徹底探索。由于基于PC標(biāo)記的高表達(dá)，傳統(tǒng)的基于轉(zhuǎn)錄組的軌跡分析可能無法準(zhǔn)確反映真實(shí)的分化狀態(tài)。為了解決這個(gè)問題，使用BCR克隆共享策略和無監(jiān)督聚類來識(shí)別ASCs的祖細(xì)胞，并通過RNA-seq和TCR跟蹤的單T細(xì)胞分析配對(duì)過渡指數(shù)(pTrans)、Jaccard指數(shù)和體細(xì)胞超突變(SHM)來進(jìn)行追蹤，表明BCR免疫組庫(kù)是追蹤ASCs譜系的可靠分子標(biāo)簽。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AtM和Bm細(xì)胞是與ASCs克隆共享的兩個(gè)原代B細(xì)胞，這表明ASCs可能起源于典型的GC和替代的濾泡外通路途徑。GC和EF反應(yīng)在不同的腫瘤中具有對(duì)應(yīng)的明顯反應(yīng)特征。以上表明兩個(gè)進(jìn)化路徑(GC和EF)被不同的癌癥生態(tài)系統(tǒng)劫持。
文章進(jìn)一步分析了BCR庫(kù)，并匹配了這兩種進(jìn)化路徑的轉(zhuǎn)錄特征。為了比較EF和GC來源的ASCs分化的早期和晚期，使用了cytoTRACE、scTour和Monocle3三種方法來推斷分化狀態(tài)，結(jié)果進(jìn)一步支持了EF衍生ASCs的早期反應(yīng)與GC衍生ASCs的延后反應(yīng)形成對(duì)比的觀點(diǎn)�？偟膩碚f，不同的癌癥生態(tài)系統(tǒng)劫持了兩條進(jìn)化路徑(EF和GC)，并揭示了EF和GC衍生的ASCs之間BCR譜和轉(zhuǎn)錄特征的差異，表明了它們?cè)诳鼓[瘤反應(yīng)中的獨(dú)特作用(圖2M)。

5、表觀遺傳學(xué)上調(diào)控元件在調(diào)控濾泡外和生發(fā)中心的平衡
轉(zhuǎn)錄調(diào)控是決定和維持B細(xì)胞身份的基礎(chǔ)。文章應(yīng)用配對(duì)scRNA-seq和scATAC-seq 來表征TIBs的表觀基因組學(xué)，并獲得了來自5種癌癥類型的9名患者的53,428個(gè)TIBs的染色質(zhì)可及性圖譜。在scRNA-seq和scATAC-seq中得到的B細(xì)胞亞型及亞型的marker具有高度一致性(圖3B)。隨著B細(xì)胞分化，這些TF活性在EF和GC 腫瘤之間有所不同。隨后評(píng)估了TF偏差評(píng)分，以確定EF和GC腫瘤之間調(diào)節(jié)因子的差異。

6、濾泡外的AtM B細(xì)胞具有耗竭表型，獨(dú)立于生發(fā)中心發(fā)育
AtM B細(xì)胞作為EF路徑的主要祖細(xì)胞在TME中起關(guān)鍵作用，研究人員全面研究了它們的表型和功能。AtM B細(xì)胞高度表達(dá)BCR信號(hào)(SYK)、免疫調(diào)節(jié)和激活基因(TLR7/9、CD80、CD86和CD72)。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了這些獨(dú)特的表型(圖4B)。這些數(shù)據(jù)共同證明了濾泡外AtM B細(xì)胞的獨(dú)特免疫表型和分子特征。同時(shí)，在Bm中觀察到體細(xì)胞高度突變（SHM），但在AtM B細(xì)胞中觀察到低或中等水平�？偟膩碚f數(shù)據(jù)表明，耗竭的AtM B細(xì)胞表現(xiàn)出抗體分泌能力受損、旁觀者激活和弱腫瘤反應(yīng)性，獨(dú)立于生發(fā)中心發(fā)育。

7、濾泡外B細(xì)胞空間分布于未成熟的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)中
TLSs通常由不同大小和細(xì)胞組成的B細(xì)胞形成。TLSs和TIBs，特別是AtM B細(xì)胞之間的空間結(jié)構(gòu)和關(guān)系尚不清楚。因此著重對(duì)這一部分做了探討。根據(jù)T細(xì)胞和B細(xì)胞的數(shù)量以及fDC染色將T細(xì)胞和B細(xì)胞分為4個(gè)階段(圖5A)。在COAD和LIHC中，AtM B細(xì)胞在未成熟TLSs中顯著富集，而Bm細(xì)胞主要位于成熟TLSs中(圖5B和5C)。不同TLSs階段的ASC密度沒有差異。AtM B細(xì)胞主要位于未成熟TLSs的中心，這與早期EF反應(yīng)和TLS形成的促進(jìn)一致(圖5D和5E)。隨著TLS成熟，AtM B細(xì)胞遷移到外圍，而naïve B細(xì)胞始終位于TLSs的中心。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了AtM B細(xì)胞不依賴GC的發(fā)育，也表明TLS成熟階段驅(qū)動(dòng)EF和GC 癌癥中不同的B細(xì)胞分化。

8、谷氨酰胺代謝建立了濾泡外AtM B細(xì)胞的表觀遺傳特性
接下來，團(tuán)隊(duì)研究了哪些因素在機(jī)制上驅(qū)動(dòng)了TME對(duì)EF和GC路徑的主要反應(yīng)。B細(xì)胞的通路分析顯示，不同人類癌癥類型的代謝途徑存在很大差異，這表明B細(xì)胞身份可能受到代謝調(diào)節(jié)。鑒于谷氨酰胺在TME中的重要作用和大量豐度，在隊(duì)列中研究了谷氨酰胺與B細(xì)胞免疫表型之間的關(guān)系。通過質(zhì)譜分析表明，EF反應(yīng)優(yōu)勢(shì)型癌癥(LIHC、CESC和RCC)的谷氨酰胺含量明顯高于GC反應(yīng)優(yōu)勢(shì)型癌癥。在LIHC中，腫瘤中的谷氨酰胺水平明顯高于鄰近正常組織，而COAD和STAD這兩種GC優(yōu)勢(shì)型癌癥的谷氨酰胺水平低于鄰近正常組織。因此谷氨酰胺代謝可能在TME中啟動(dòng)EF反應(yīng)中起潛在作用。進(jìn)一步證明了谷氨酰胺衍生的代謝物α-酮戊二酸（α-KG）可以增加AtM B細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T-bet和BATF的表達(dá)并促進(jìn)其分化，同時(shí)激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素復(fù)合物1（mTORC1）信號(hào)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一假設(shè)。

9、濾泡外B細(xì)胞形成免疫調(diào)節(jié)生態(tài)位，與人類癌癥預(yù)后不良有關(guān)
鑒于濾泡外AtM B細(xì)胞和T細(xì)胞在TLSs內(nèi)的空間共定位，進(jìn)一步探索了AtM B細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的潛在影響(圖6A)。刺激后，經(jīng)過篩選的LIHC浸潤(rùn)的AtM B細(xì)胞比非AtM B細(xì)胞分泌更多的IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子- B (TGFb)，表達(dá)更高的PD-L1，與對(duì)照相比，谷氨酰胺誘導(dǎo)的B細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)。用谷氨酰胺誘導(dǎo)外周B細(xì)胞進(jìn)入AtM，并與外周CD3+ T細(xì)胞體外共培養(yǎng)。AtM B細(xì)胞可以減少CD4+和CD8+ T細(xì)胞的增殖(圖6M)，并損害T細(xì)胞產(chǎn)生IFNg、腫瘤壞死因子- a (TNFa)和顆粒酶B的能力(圖N)。AtM B細(xì)胞促進(jìn)T向Treg細(xì)胞和耗竭T細(xì)胞分化。

文章最后探討了Bm和AtM B細(xì)胞在癌癥中的預(yù)后價(jià)值。Bm細(xì)胞與良好的預(yù)后相關(guān)，而AtM B細(xì)胞則相反。此外，在接受抗pd1治療的黑色素瘤(n = 26)和肺癌(n = 21)的已發(fā)表隊(duì)列中，AtM B細(xì)胞的豐度與治療耐藥性顯著相關(guān)，而Bm細(xì)胞與改善的應(yīng)答和更長(zhǎng)的生存期相關(guān)(圖P和Q)。總的來說，這些觀察結(jié)果表明，EF來源的B細(xì)胞與未成熟的TLSs和耗竭T細(xì)胞相關(guān)，導(dǎo)致某些癌癥的免疫治療耐藥性和預(yù)后不良。

04 文章亮點(diǎn)和研究啟示
（1）本文通過大規(guī)模單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)編制了全面的泛癌B細(xì)胞圖譜，深度解析了人類癌癥中B細(xì)胞異質(zhì)性和兩種動(dòng)態(tài)分化途徑，為未來的研究提供了ASCs分化軌跡的基礎(chǔ)參考；
（2）通過單細(xì)胞水平的多組學(xué)聯(lián)合分析比較了EF和GC應(yīng)答，揭示了不同癌癥類型中B細(xì)胞狀態(tài)的異同，突出了與EF通路相關(guān)的AtM B細(xì)胞免疫抑制微環(huán)境相關(guān)的不利臨床結(jié)果；
（3）代謝-表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)非常靈活，鎖定了關(guān)鍵代謝物谷氨酰胺衍生的代謝物α-酮戊二酸（α-KG），其可以增加AtM B細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，重新配置B細(xì)胞命運(yùn)，從而促進(jìn)B細(xì)胞靶向免疫療法的發(fā)展。