表觀多組學揭示SETDB1調(diào)控神經(jīng)前體細胞的短散在核元件和染色質(zhì)環(huán)構象
轉(zhuǎn)座元件（TE）在神經(jīng)發(fā)育期間的維持基因組結構中起著關鍵作用。短散在核元件（Short Interspersed Nuclear Elements，SINE） 是轉(zhuǎn)座元件的主要亞型，已知含有 CCCTC 結合因子 （CTCF） 的結合位點，并在調(diào)控染色質(zhì)構象中具有重要作用。然而SINEs在發(fā)育中的大腦的活性調(diào)控機制尚不清楚。
2024年7月3日，復旦大學腦科學研究院江燕課題組與基礎醫(yī)學院劉赟課題組博士后蒙偉達合作共同通訊，利用廣泛的表觀基因組分析，包括ATAC-seq、抗H3K9me3 ChIP-seq、WGBS、抗CTCF ChIP-seq、原位Hi-C以及RNA-seq分析，揭示了小鼠神經(jīng)前體細胞（NPCs）中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1調(diào)控SINEs活性和染色質(zhì)環(huán)構象的表觀遺傳分子機制，及其在NPCs增殖中的作用。相關研究成果以“SETDB1 regulates short interspersed nuclear elements and chromatin loop organization in mouse neural precursor cells”為題發(fā)表在《基因組生物學》（Genome Biology）雜志上。
標題：SETDB1 regulates short interspersed nuclear elements and chromatin loop organization in mouse neural precursor cells
時間：2024.07.03
期刊：Genome Biology
影響因子：IF 10.1 / 1區(qū)
實驗方法：ChIP-seq、WGBS、ATAC-seq、Hi-C、RNA-seq
研究方法：
使用ATAC-seq、ChIP-seq、全基因組亞硫酸鹽測序(WGBS)、原位Hi-C和RNA-seq等技術，在小鼠神經(jīng)前體細胞中進行了全基因組范圍的表觀遺傳分析。
研究結果：
本研究通過對小鼠神經(jīng)前體細胞（NPCs）進行全面的全基因組表觀遺傳分析，研究結果表明，SETDB1介導的H3K9me3與DNA甲基化發(fā)揮協(xié)同作用，抑制了神經(jīng)前體細胞中特定類群SINEs位點的染色質(zhì)可及性。Setdb1基因敲除增加了CTCF對這些SINE元件的可及性，CTCF與這些位點結合介導染色質(zhì)環(huán)的重分布。而新形成的染色質(zhì)環(huán)參與調(diào)控基因表達，包括調(diào)控有絲分裂功能通路中富集的基因失調(diào)，從而影響神經(jīng)前體細胞的細胞周期。此外，Setdb1基因敲除在體內(nèi)和體外導致胚胎大腦中細胞增殖破壞。研究揭示了小鼠神經(jīng)前體細胞中SINEs的表觀遺傳調(diào)控，表明其在維持神經(jīng)發(fā)育期間的染色質(zhì)構象和細胞增殖中的作用�？傊�，本研究揭示了發(fā)育腦中SETDB1調(diào)控SINEs元件和三維染色質(zhì)構象的分子機制，并為轉(zhuǎn)座元件參與神經(jīng)發(fā)育提供新的理論依據(jù)。
研究亮點：
結果圖形：
（1）小鼠神經(jīng)前體細胞敲除Setdb1后，SINE_B2元件的染色質(zhì)可及性增加
為了研究SETDB1對發(fā)育中大腦TE的調(diào)控作用，研究人員在小鼠胚胎第15.5天（E15.5）從野生型（WT）和SETDB1敲除（KO）的大腦中分離出神經(jīng)節(jié)隆起（ganglionic eminences，GE），并進行神經(jīng)球培養(yǎng)。收獲純化的NPC進行各種表觀基因組分析，包括全基因組染色質(zhì)可及性（ATAC-seq）、H3K9me3和CTCF占位情況（ChIP-seq）、DNA甲基化（WGBS）、3D基因組組織（原位Hi-C）和基因轉(zhuǎn)錄（RNA-seq）的分析（圖1）。
圖1：小鼠神經(jīng)前體細胞中敲除Setdb1基因后，SINE_B2元件染色質(zhì)可及性增加的實驗過程和結果
通過以上表觀多組學技術分析揭示了Setdb1基因敲除對小鼠神經(jīng)前體細胞中SINE_B2元件染色質(zhì)可及性的作用，包括轉(zhuǎn)座元件活性和特定基因組區(qū)域開放性變化。分析結果表明特定SINE_B2元件類群的染色質(zhì)可及性受 NPC 中 SETDB1調(diào)控。
（2）NPC Setdb1敲除后SINE_B2上H3K9me3減少
SETDB1是最重要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶之一，對H3K9me3具有特異性。因此作者研究了SETDB1是否通過H3K9me3沉積抑制NPC中SINE_B2元件的染色質(zhì)可及性。為了探索這一點，作者在WT和KO的NPC中進行了抗H3K9me3 ChIP-seq。隨后分析了ATAC-seq和H3K9me3ChIP-seq數(shù)據(jù)集的差異peaks之間的信號相關性。
B. 火山圖顯示了H3K9me3 ChIP-seq的差異分析。KO/WT，N = 3，F(xiàn)DR < 0.05，|Log2FoldChange| ≥ 0.585。紅色表示上調(diào)，藍色表示下調(diào)，灰色表示無顯著變化(Non_sig)。
C. 在小鼠基因組上下調(diào)H3K9me3峰(K9_down)的富集分析。
D. K9_down在“TE_class”(左)，“SINE_family”(中)和“B2_subtype”(右)上的富集。虛線表示P-adj = 0.05。Fisher精確檢驗，B-H校正，**P < 0.01，***P < 0.001，P < 0.0001。
E. 在與ATAC_up重疊的B2位點(ATAC_up_B2)上的H3K9me3信號剖面和熱圖。
F. 在與K9_down重疊的B2位點(K9_down_B2)上的ATAC-seq信號剖面和熱圖。
G. IGV地圖軌跡顯示了Chr5上WT和KO的H3K9me3(K9)信號。垂直條表示K9_down和ATAC_up_B2的位置。黃色陰影表示放大的區(qū)域i和ii。
（3）Setdb1敲除后NPCs DNA甲基化的變化
先前研究表明了SETDB1介導的H3K9me3與DNA甲基化在神經(jīng)元基因簇上的互作。為此，本研究在WT（野生型）和KO（敲除型）的神經(jīng)前體細胞(NPCs)中進行WGBS（全基因組亞硫酸鹽測序）以檢測DNA甲基化。隨后，分析評估DMR和ATAC-seq峰之間的交集。
B. TEs（轉(zhuǎn)座元件）、SINEs和非TE區(qū)域的DMR和全基因組MeanDiff和AvgMeth。
C. 小鼠基因組上顯著低甲基化DMRs（DMR_hypo）的富集情況。
D. DMR_hypo在“TE_class”（左）、“SINE_family”（中）和“B2_subtype”（右）上的富集情況。虛線表示P-adj = 0.05。Fisher精確檢驗，B-H校正，P < 0.0001。
E. 重疊DMRs和ATAC-seq峰（DMR & ATAC）的MeanDiff和ATAC-seq信號的Log2FoldChange（ATAC_log2FC）。sig_B2/all表示B2/所有DMR & ATAC峰上顯著DMR & ATAC峰的數(shù)量。紫色代表sig_B2。灰色代表non-sig_B2。注意sig_B2在第四象限富集。Fisher精確檢驗，P < 0.0001。
F. (E)中第四象限sig_B2的H3K9me3信號剖面和熱圖。
G. IGV圖軌跡展示了WT和KO在重疊DMR_hypo、K9_down和ATAC_up_B2位點上的DNA甲基化水平。
（4）NPC Setdb1敲除后CTCF對SINE_B2結合增加
已知SINE_B2元件具有攜帶CTCF結合位點（CBS）的潛力。目前的研究中，B2元件中 CTCF motif的富集具有 ATAC_up、K9_down 和 DMR_hypo 事件。因此，研究人員進行了抗CTCF ChIP-seq來表征WT和KO NPC中的CTCF結合圖譜。隨后對CTCF ChIP-seq、ATAC-seq 和 WGBS 數(shù)據(jù)集進行綜合分析。
B. 在小鼠基因組上上調(diào)的CTCF峰(CTCF_up)的富集情況。
C. 重疊(CTCF_up_B2, 左)和不重疊B2元件(CTCF_up_NonB2, 右)的CTCF_up峰的前10個富集的Homer已知motif。
D-G. CTCF ChIP-seq (D)、ATAC-seq (E)、H3K9me3 ChIP-seq (F)和WGBS (G)在CTCF_up_B2上的信號剖面和熱圖。
H. IGV圖軌跡展示了(D-G)中CTCF_up_B2上的代表性信號。
I. 密度圖顯示了所有CTCF峰(All, 紫色)、CTCF_up (Up, 藍色)和CTCF_up_B2 (Up_B2, 紅色)到轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)的距離�；疑幱�，啟動子區(qū)域(TSS ± 3 Kb)。
（5）Setdb1 敲除后 CTCF 結合增加的SINE_B2染色質(zhì)環(huán)重分布
近年來，CTCF因其在維持三維基因組結構中的中心作用而得到了廣泛研究，主要通過介導染色質(zhì)折疊實現(xiàn)。本研究分析了全基因組CTCF結合增加對KO NPCs（敲除型神經(jīng)前體細胞）中染色質(zhì)構象的作用。
（6）Setdb1 敲除后與環(huán)重分布相關的差異基因表達
研究小結：
本研究數(shù)據(jù)結果揭示了小鼠神經(jīng)前體細胞（NPCs）中特定SINE_B2元件類群的表觀遺傳特征。這些SINE_B2元件在SETDB1介導的H3K9me3調(diào)控下，與DNA甲基化協(xié)同發(fā)揮作用，促進CTCF結合和染色質(zhì)環(huán)形成，并調(diào)控對小鼠大腦發(fā)育期間NPC增殖至關重要的有絲分裂基因。
參考文獻：
1、Sun D, Zhu Y, Peng W, Zheng S, Weng J, Dong S, Li J, Chen Q, Ge C, Liao L, Dong Y, Liu Y, Meng W, Jiang Y. SETDB1 regulates short interspersed nuclear elements and chromatin loop organization in mouse neural precursor cells. Genome Biol. 2024 Jul 3;25(1):175. pii: 10.1186/s13059-024-03327-2. doi: 10.1186/s13059-024-03327-2. PubMed PMID: 38961490.
2、江燕課題組合作研究揭示SETDB1調(diào)控神經(jīng)前體細胞中短散在核元件和染色質(zhì)環(huán)構象的分子機制 (fudan.edu.cn)
2024年7月3日，復旦大學腦科學研究院江燕課題組與基礎醫(yī)學院劉赟課題組博士后蒙偉達合作共同通訊，利用廣泛的表觀基因組分析，包括ATAC-seq、抗H3K9me3 ChIP-seq、WGBS、抗CTCF ChIP-seq、原位Hi-C以及RNA-seq分析，揭示了小鼠神經(jīng)前體細胞（NPCs）中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1調(diào)控SINEs活性和染色質(zhì)環(huán)構象的表觀遺傳分子機制，及其在NPCs增殖中的作用。相關研究成果以“SETDB1 regulates short interspersed nuclear elements and chromatin loop organization in mouse neural precursor cells”為題發(fā)表在《基因組生物學》（Genome Biology）雜志上。
標題：SETDB1 regulates short interspersed nuclear elements and chromatin loop organization in mouse neural precursor cells
時間：2024.07.03
期刊：Genome Biology
影響因子：IF 10.1 / 1區(qū)
實驗方法：ChIP-seq、WGBS、ATAC-seq、Hi-C、RNA-seq
研究方法：
使用ATAC-seq、ChIP-seq、全基因組亞硫酸鹽測序(WGBS)、原位Hi-C和RNA-seq等技術，在小鼠神經(jīng)前體細胞中進行了全基因組范圍的表觀遺傳分析。
研究結果：
本研究通過對小鼠神經(jīng)前體細胞（NPCs）進行全面的全基因組表觀遺傳分析，研究結果表明，SETDB1介導的H3K9me3與DNA甲基化發(fā)揮協(xié)同作用，抑制了神經(jīng)前體細胞中特定類群SINEs位點的染色質(zhì)可及性。Setdb1基因敲除增加了CTCF對這些SINE元件的可及性，CTCF與這些位點結合介導染色質(zhì)環(huán)的重分布。而新形成的染色質(zhì)環(huán)參與調(diào)控基因表達，包括調(diào)控有絲分裂功能通路中富集的基因失調(diào)，從而影響神經(jīng)前體細胞的細胞周期。此外，Setdb1基因敲除在體內(nèi)和體外導致胚胎大腦中細胞增殖破壞。研究揭示了小鼠神經(jīng)前體細胞中SINEs的表觀遺傳調(diào)控，表明其在維持神經(jīng)發(fā)育期間的染色質(zhì)構象和細胞增殖中的作用�？傊�，本研究揭示了發(fā)育腦中SETDB1調(diào)控SINEs元件和三維染色質(zhì)構象的分子機制，并為轉(zhuǎn)座元件參與神經(jīng)發(fā)育提供新的理論依據(jù)。
研究亮點：
- 本研究首次揭示SETDB1通過H3K9me3和DNA甲基化協(xié)同發(fā)揮對SINEs的調(diào)控作用，為理解神經(jīng)發(fā)育中的表觀遺傳機制提供了新的視角。
- 研究揭示了SINEs在神經(jīng)發(fā)育中的新功能，尤其是在細胞增殖調(diào)控中的作用。
- 研究結果強調(diào)了表觀遺傳修飾在神經(jīng)發(fā)育中的重要性，并為未來的神經(jīng)發(fā)育和相關疾病研究提供了潛在的靶點。
- 整體來看，本研究深入探討了SETDB1在神經(jīng)發(fā)育中的表觀遺傳調(diào)控作用，特別是在染色質(zhì)構象和基因表達調(diào)控中的功能，為理解大腦發(fā)育和相關疾病的分子機制提供了重要信息。
結果圖形：
（1）小鼠神經(jīng)前體細胞敲除Setdb1后，SINE_B2元件的染色質(zhì)可及性增加
為了研究SETDB1對發(fā)育中大腦TE的調(diào)控作用，研究人員在小鼠胚胎第15.5天（E15.5）從野生型（WT）和SETDB1敲除（KO）的大腦中分離出神經(jīng)節(jié)隆起（ganglionic eminences，GE），并進行神經(jīng)球培養(yǎng)。收獲純化的NPC進行各種表觀基因組分析，包括全基因組染色質(zhì)可及性（ATAC-seq）、H3K9me3和CTCF占位情況（ChIP-seq）、DNA甲基化（WGBS）、3D基因組組織（原位Hi-C）和基因轉(zhuǎn)錄（RNA-seq）的分析（圖1）。
通過以上表觀多組學技術分析揭示了Setdb1基因敲除對小鼠神經(jīng)前體細胞中SINE_B2元件染色質(zhì)可及性的作用，包括轉(zhuǎn)座元件活性和特定基因組區(qū)域開放性變化。分析結果表明特定SINE_B2元件類群的染色質(zhì)可及性受 NPC 中 SETDB1調(diào)控。
（2）NPC Setdb1敲除后SINE_B2上H3K9me3減少
SETDB1是最重要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶之一，對H3K9me3具有特異性。因此作者研究了SETDB1是否通過H3K9me3沉積抑制NPC中SINE_B2元件的染色質(zhì)可及性。為了探索這一點，作者在WT和KO的NPC中進行了抗H3K9me3 ChIP-seq。隨后分析了ATAC-seq和H3K9me3ChIP-seq數(shù)據(jù)集的差異peaks之間的信號相關性。
圖2：NPCs中敲除Setdb1基因后，SINE_B2元件上H3K9me3水平降低的實驗分析和結果
A. 野生型(WT)和敲除型(KO)神經(jīng)前體細胞中H3K9me3 ChIP-seq的相關性熱圖。B. 火山圖顯示了H3K9me3 ChIP-seq的差異分析。KO/WT，N = 3，F(xiàn)DR < 0.05，|Log2FoldChange| ≥ 0.585。紅色表示上調(diào)，藍色表示下調(diào)，灰色表示無顯著變化(Non_sig)。
C. 在小鼠基因組上下調(diào)H3K9me3峰(K9_down)的富集分析。
D. K9_down在“TE_class”(左)，“SINE_family”(中)和“B2_subtype”(右)上的富集。虛線表示P-adj = 0.05。Fisher精確檢驗，B-H校正，**P < 0.01，***P < 0.001，P < 0.0001。
E. 在與ATAC_up重疊的B2位點(ATAC_up_B2)上的H3K9me3信號剖面和熱圖。
F. 在與K9_down重疊的B2位點(K9_down_B2)上的ATAC-seq信號剖面和熱圖。
G. IGV地圖軌跡顯示了Chr5上WT和KO的H3K9me3(K9)信號。垂直條表示K9_down和ATAC_up_B2的位置。黃色陰影表示放大的區(qū)域i和ii。
（3）Setdb1敲除后NPCs DNA甲基化的變化
先前研究表明了SETDB1介導的H3K9me3與DNA甲基化在神經(jīng)元基因簇上的互作。為此，本研究在WT（野生型）和KO（敲除型）的神經(jīng)前體細胞(NPCs)中進行WGBS（全基因組亞硫酸鹽測序）以檢測DNA甲基化。隨后，分析評估DMR和ATAC-seq峰之間的交集。
圖3：NPCs中敲除Setdb1基因后DNA甲基化變化。
A. MA圖顯示了來自WT（野生型）和KO（敲除型）NPCs的WGBS的差異甲基化區(qū)域（DMRs）。N = 2, |MeanDiff| ≥ 0.1。紅色代表高甲基化（Hyper）。藍色代表低甲基化（Hypo）�；疑頍o顯著變化（Non_sig）。AvgMeth代表平均DNA甲基化水平。MeanDiff代表KO和WT之間的平均DNA甲基化差異。B. TEs（轉(zhuǎn)座元件）、SINEs和非TE區(qū)域的DMR和全基因組MeanDiff和AvgMeth。
C. 小鼠基因組上顯著低甲基化DMRs（DMR_hypo）的富集情況。
D. DMR_hypo在“TE_class”（左）、“SINE_family”（中）和“B2_subtype”（右）上的富集情況。虛線表示P-adj = 0.05。Fisher精確檢驗，B-H校正，P < 0.0001。
E. 重疊DMRs和ATAC-seq峰（DMR & ATAC）的MeanDiff和ATAC-seq信號的Log2FoldChange（ATAC_log2FC）。sig_B2/all表示B2/所有DMR & ATAC峰上顯著DMR & ATAC峰的數(shù)量。紫色代表sig_B2。灰色代表non-sig_B2。注意sig_B2在第四象限富集。Fisher精確檢驗，P < 0.0001。
F. (E)中第四象限sig_B2的H3K9me3信號剖面和熱圖。
G. IGV圖軌跡展示了WT和KO在重疊DMR_hypo、K9_down和ATAC_up_B2位點上的DNA甲基化水平。
（4）NPC Setdb1敲除后CTCF對SINE_B2結合增加
已知SINE_B2元件具有攜帶CTCF結合位點（CBS）的潛力。目前的研究中，B2元件中 CTCF motif的富集具有 ATAC_up、K9_down 和 DMR_hypo 事件。因此，研究人員進行了抗CTCF ChIP-seq來表征WT和KO NPC中的CTCF結合圖譜。隨后對CTCF ChIP-seq、ATAC-seq 和 WGBS 數(shù)據(jù)集進行綜合分析。
圖4：NPCs中Setdb1基因敲除后，CTCF結合在SINE_B2元件上的增加情況。
A. 火山圖展示了差異CTCF ChIP-seq峰。KO/WT，N = 3，F(xiàn)DR < 0.05，|Log2FoldChange| ≥ 0.585。紅色代表上調(diào)，藍色代表下調(diào)，灰色代表無顯著變化(Non_sig)。B. 在小鼠基因組上上調(diào)的CTCF峰(CTCF_up)的富集情況。
C. 重疊(CTCF_up_B2, 左)和不重疊B2元件(CTCF_up_NonB2, 右)的CTCF_up峰的前10個富集的Homer已知motif。
D-G. CTCF ChIP-seq (D)、ATAC-seq (E)、H3K9me3 ChIP-seq (F)和WGBS (G)在CTCF_up_B2上的信號剖面和熱圖。
H. IGV圖軌跡展示了(D-G)中CTCF_up_B2上的代表性信號。
I. 密度圖顯示了所有CTCF峰(All, 紫色)、CTCF_up (Up, 藍色)和CTCF_up_B2 (Up_B2, 紅色)到轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)的距離�；疑幱�，啟動子區(qū)域(TSS ± 3 Kb)。
（5）Setdb1 敲除后 CTCF 結合增加的SINE_B2染色質(zhì)環(huán)重分布
近年來，CTCF因其在維持三維基因組結構中的中心作用而得到了廣泛研究，主要通過介導染色質(zhì)折疊實現(xiàn)。本研究分析了全基因組CTCF結合增加對KO NPCs（敲除型神經(jīng)前體細胞）中染色質(zhì)構象的作用。
圖5：在Setdb1基因敲除后，CTCF結合增加導致SINE_B2上的染色質(zhì)環(huán)重新分布
（6）Setdb1 敲除后與環(huán)重分布相關的差異基因表達
圖6：Setdb1敲除后與環(huán)重分布相關的差異基因表達。
圖7：Setdb1敲除后影響NPC增殖。
研究小結：
本研究數(shù)據(jù)結果揭示了小鼠神經(jīng)前體細胞（NPCs）中特定SINE_B2元件類群的表觀遺傳特征。這些SINE_B2元件在SETDB1介導的H3K9me3調(diào)控下，與DNA甲基化協(xié)同發(fā)揮作用，促進CTCF結合和染色質(zhì)環(huán)形成，并調(diào)控對小鼠大腦發(fā)育期間NPC增殖至關重要的有絲分裂基因。
參考文獻：
1、Sun D, Zhu Y, Peng W, Zheng S, Weng J, Dong S, Li J, Chen Q, Ge C, Liao L, Dong Y, Liu Y, Meng W, Jiang Y. SETDB1 regulates short interspersed nuclear elements and chromatin loop organization in mouse neural precursor cells. Genome Biol. 2024 Jul 3;25(1):175. pii: 10.1186/s13059-024-03327-2. doi: 10.1186/s13059-024-03327-2. PubMed PMID: 38961490.
2、江燕課題組合作研究揭示SETDB1調(diào)控神經(jīng)前體細胞中短散在核元件和染色質(zhì)環(huán)構象的分子機制 (fudan.edu.cn)
標簽：
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