雙抗副產(chǎn)物的下游工藝策略

雙特異性抗體（Bispecific antibody，BsAb，簡(jiǎn)稱(chēng)雙抗）是指能夠特異性的結(jié)合兩個(gè)抗原或兩種特異性表位的人工抗體。

根據(jù)雙抗結(jié)構(gòu)劃分，可分為IgG-like雙特性異性（含有Fc區(qū)）和non-IgG-like雙特異性抗體（不含F(xiàn)c區(qū)）。IgG-like雙特性異性:含有FC區(qū)，分子量相對(duì)較大，F(xiàn)C區(qū)也有助抗體后期的純化�？商岣呷芙庑裕�穩(wěn)定性，具有FC介導(dǎo)的效應(yīng)功能。

Non-IgG-like雙特異性抗體：非IgG-like雙抗在設(shè)計(jì)時(shí)去除了FC區(qū)，分子量一般較小，滲透性強(qiáng)，半衰期短，相對(duì)而言具有易于生產(chǎn)的特點(diǎn)。
雙抗在重組表達(dá)過(guò)程中會(huì)不可避免的產(chǎn)生錯(cuò)配，不完整片段，以及聚集等副產(chǎn)物，這些雙抗的副產(chǎn)物主要分為：①錯(cuò)配（主要包括重鏈之間錯(cuò)配引起的同源抗體，輕鏈與重鏈之間錯(cuò)配引起的異源抗體），②抗體片段（缺失重鏈和輕鏈的雙抗副產(chǎn)物：如半抗體，3/4抗體），③聚體（輕鏈聚集體，重鏈聚集體）等，這些雙抗副產(chǎn)物為雙抗藥物的下游工藝提出了較大的挑戰(zhàn)。  
針對(duì)不同的雙抗類(lèi)型，需要多樣化的純化平臺(tái)來(lái)進(jìn)行雜質(zhì)的去除，通�？梢赃M(jìn)行以下路線的選擇：   Protein A親和層析在雙抗純化中具有捕獲和除雜的功能，是使用最多的一種層析方法。典型的親和層析是pH7.2±0.2的緩沖液中上樣，平衡緩沖液淋洗，醋酸，檸檬酸或甘氨酸緩沖液含有300~1000mM氯化鈉在pH5.0~6.0條件下洗雜，然后使用醋酸，檸檬酸或甘氨酸緩沖液在pH4.0~2.5條件下洗脫或者梯度洗脫。Protein A可以去除同源抗體，半抗及3/4抗體。對(duì)于一般難以去除的副產(chǎn)物，可以通過(guò)添加一定成分的添加物進(jìn)行去除，比如：在洗脫和洗雜緩沖液中添加CaCl₂可以提高半抗和同源聚體的去除；在洗脫和洗雜緩沖液中添加精氨酸可以提高半抗，工藝殘留的去除；在洗脫和洗雜緩沖液中添加MgCl₂可以提高同源聚體的去除。
 
MaXtar^® ARPA是一款耐0.5 mol/L堿，高載量，高分辨率的Protein A填料，在半抗，3/4抗體，同源聚體，單鏈缺失及聚體類(lèi)雙抗副產(chǎn)物去除表現(xiàn)良好。目前廣泛應(yīng)用在多個(gè)抗體藥物的商業(yè)化生產(chǎn)中。
  離子交換層析是利用雙抗與雙抗副產(chǎn)物的等電點(diǎn)PI的差異，通過(guò)鹽梯度或pH梯度進(jìn)行分離純化，在抗體純化應(yīng)用最多的精純步驟。一般情況下，只要雙抗與雙抗副產(chǎn)物的PI差異在0.5以上，就可以使用離子交換層析分離開(kāi)。離子交換層析可以去去除同源聚體，3/4抗體，聚體。對(duì)于特別難以去除的3/4抗體，可以?xún)?yōu)化緩沖液中添加PEG，CaCl₂，精氨酸等，使用pH梯度的陽(yáng)離子交換層析，可以獲得較好的去除效果。

MaXtar^® Q、MaXtar^® Q HR、MaXtar^® S/SP、MaXtar^® SP HR在抗體純化中應(yīng)用比較經(jīng)典的離子交換層析填料。MaXtar^® S HC是一款高分辨，高載量（可達(dá)100mg IgG/ml以上的填料）的陽(yáng)離子交換層析填料。
  疏水層析根據(jù)雙抗與雙抗副產(chǎn)物的疏水性差異進(jìn)行分離。在高鹽濃度下，雙抗表面疏水殘基暴露，與疏水填料表面結(jié)合，隨鹽濃度的降低，使得不同疏水強(qiáng)度的雙抗與雙抗副產(chǎn)物進(jìn)行分離。高鹽濃度的緩沖液可能使蛋白與層析填料產(chǎn)生不可逆結(jié)合，在疏水緩沖液中添加5~15%的PEG或精氨酸可以促進(jìn)洗脫和提高洗脫效果，增加回收率；也可使用高分辨率的MaXtar^® Phenyl HR或MaXtar^® Butyl HR的層析填料，以結(jié)合或流穿模式去除聚體。
 
MaXtar^® Phenyl、MaXtar^® Phenyl HR、MaXtar^® Butyl、MaXtar^® Butyl HR在雙抗純化可以有效的去除重鏈和輕鏈，聚體等雙抗副產(chǎn)物。
  混合模式層析利用層析填料的兩種或兩種以上相互作用機(jī)理進(jìn)行分離的方法。比如：CHT可同時(shí)實(shí)現(xiàn)陽(yáng)離子交換和鈣金屬親和兩種分離機(jī)制及MMC/MMA具有弱陽(yáng)離子/陰離子交換和疏水層析兩種層析機(jī)理，可取去除同源聚體；由于復(fù)合模式層析的雙機(jī)理的分離功能，在去除雙抗副產(chǎn)物種具有獨(dú)特效果。混合模式層析在雙抗純化種應(yīng)用非常廣泛。 由于雙抗比單抗的副產(chǎn)物更復(fù)雜，需要針對(duì)不同類(lèi)型的雙抗，依據(jù)親和力，電荷，疏水性等性質(zhì)差異，設(shè)計(jì)多種不同的下游工藝路線，去除副產(chǎn)物，提高雙抗的純度。百林科可以提供雙抗純化不同純化工藝路線如表2，表3-1，表3-2，在各種雙抗項(xiàng)目種表現(xiàn)優(yōu)異。  

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