填料吸附色素的來(lái)源與去除的方法優(yōu)化

吸附色素對(duì)填料的影響：色素沉積在層析柱中，不僅對(duì)其分辨率，收率有影響，更嚴(yán)重影響其使用壽命。
  色素污染層析填料的具體表現(xiàn)是含有色素的中間體在層析系統(tǒng)上樣過(guò)程中，色素會(huì)首先與層析柱上層填料結(jié)合，導(dǎo)致層析填料由乳白色變成色素相應(yīng)的顏色，隨著上樣量和填料循環(huán)數(shù)的增加，色素會(huì)逐步擴(kuò)散到中下層填料，嚴(yán)重時(shí)色素等雜質(zhì)帶來(lái)的污染能讓層析柱內(nèi)的填料塌陷。
 
過(guò)度積累的色素將導(dǎo)致填料的使用壽命降低，具體表現(xiàn)是填料載量明顯下降，填料外觀顏色變深。通常情況下，這些填料吸附的色素會(huì)被后續(xù)再生工序中的再生液去除，從而恢復(fù)填料性能，也避免吸附在填料上的雜質(zhì)污染下一個(gè)工藝循環(huán)，將蛋白質(zhì)原液的雜質(zhì)殘留降至最低，從而減淡蛋白質(zhì)中間體的顏色，實(shí)現(xiàn)更好的原液質(zhì)量。
  填料吸附的色素主要來(lái)源于蛋白，而影響蛋白溶液外觀、且難以去除的色素主要是由培養(yǎng)基組分在培養(yǎng)和收獲過(guò)程中與蛋白分子相互作用形成的。
 
據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，色素廣泛存在于蛋白質(zhì)中間體和最終原液中，具體表現(xiàn)為蛋白質(zhì)中間體和原液呈現(xiàn)不同的顏色，尤其在高濃度蛋白質(zhì)溶液中尤為顯著，比如哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中的維生素B12轉(zhuǎn)化為羥氧-B12之后與抗體分子結(jié)合導(dǎo)致粉色，鐵離子等的高氧化性使其在氧化應(yīng)激下產(chǎn)生高活性氧 (ROS) ，使抗體分子表面色氨酸殘基氧化導(dǎo)致黃色或黃褐色；畢赤酵母誘導(dǎo)中后期，AOX1醇氧化酶釋放進(jìn)入發(fā)酵液，結(jié)合黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 輔因子形成八聚物導(dǎo)致綠色。另外，天然互作蛋白以及小分子色素等，也可能會(huì)引入顏色。
  色素是一類物質(zhì)，不同來(lái)源的色素的清洗過(guò)程差異較大，可根據(jù)介質(zhì)的性質(zhì)及色素的性質(zhì)進(jìn)行清洗，堿洗，酸洗，有機(jī)溶劑，變性劑都可以嘗試。根據(jù)色素的不同性質(zhì)，也可以嘗試不同的去污劑，注意避免操作中產(chǎn)生氣泡。 如果去除不掉，可以定期把色素污染部分的填料去除，或驗(yàn)證是否對(duì)于樣品純化造成影響。
 
色素的去除方法：
• 鐵離子殘留帶來(lái)的黃褐色去除：
0.1M HCl+2M NaCl；0.5M磷酸。
• 維生素B12引起的粉色去除：
1M醋酸+4%半胱氨酸；0.3M組氨酸+0.5M NaCl。
• 疏水作用力結(jié)合的色素去除：
0.5-1M NaOH。
• 脂類色素：
0.5M 非離子去污劑；70%乙醇；30%異丙醇。
• 沉積的頑固色素：
1M醋酸；1M NaOH+2M NaCl；6M鹽酸胍；8M尿素。

色素清洗過(guò)程注意事項(xiàng):
• 清洗過(guò)程要綜合考慮污染物的類型及介質(zhì)的種類，清洗的同時(shí)要減少對(duì)介質(zhì)的損傷。
• 清洗使用氫氧化鈉或者其它極端條件對(duì)填料的壽命性能都有很大影響，清洗時(shí)極端條件接觸時(shí)間控制在30分鐘以內(nèi)，CIP時(shí)控制在3CV以內(nèi)。
• 清洗時(shí)除了單一的清洗方式，也可以考慮使用混合試劑進(jìn)行處理，清洗過(guò)程并非是固定不變的。
• 清洗試劑應(yīng)選擇純度高的試劑，避免二次污染。
• 清洗之后要立即放到中性保存。
• 清洗狀態(tài)的確定及方法的確定要結(jié)合整個(gè)工藝過(guò)程。
• 清洗之后要對(duì)清洗過(guò)程進(jìn)行驗(yàn)證，保證清洗目的實(shí)現(xiàn)，可通過(guò)測(cè)定載量，流速等介質(zhì)的性能指標(biāo)驗(yàn)證。
  使用1M醋酸+4%半胱氨酸對(duì)CIP清潔后呈現(xiàn)粉色色素殘留的MaXtar ARPA填料進(jìn)行再生清洗，清潔后外觀顯示可徹底清楚色素殘留。
對(duì)清潔后層析柱再生溶液進(jìn)行了收集并送檢VB12含量測(cè)定，檢測(cè)報(bào)告同樣顯示無(wú)VB12。
再生清洗前后對(duì)比：  

百林科VB12含量檢測(cè)報(bào)告：

 
參考文獻(xiàn)：
[1]翁志兵,王鵬紅,趙力,等.層析填料中頑固色素去除的新方法研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2022(002):041.

 

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