層析法去除生物制品中內(nèi)毒素的解決方案

內(nèi)毒素是生物制品中最主要的熱原污染，極微量內(nèi)毒素進入人體就會引起高熱、腹瀉、血管擴張，甚至昏厥或死亡。為最大程度地去除內(nèi)毒素和避免內(nèi)毒素污染，應(yīng)積極優(yōu)化生物制品的制備工藝。
 
不同來源的內(nèi)毒素差異性較大，即使同一樣品不同的內(nèi)毒素分子差異性也較大。
 
內(nèi)毒素的性質(zhì)差異如此之大，給內(nèi)毒素的去除帶來了極大的挑戰(zhàn)和難題。生物制品的內(nèi)毒素去除，應(yīng)結(jié)合不同生物制品的不同工藝和內(nèi)毒素的特點，尋找有效去除內(nèi)毒素的方法。
 
在層析工藝開發(fā)中，為了更好的去除生物制品中的內(nèi)毒素，需要對有內(nèi)毒素與蛋白質(zhì)相互作用的生物制品，添加不同的添加劑來解離或降低這種相互作用。

  內(nèi)毒素是一種脂多糖，三個區(qū)域結(jié)構(gòu)組成：脂質(zhì)A區(qū)，核心多糖區(qū)和特異性多糖鏈區(qū)。單體分子為10kD~20kD，在不同成分的水溶液中，形成聚集體，最大可達1000kD。內(nèi)毒素分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且不均一，導(dǎo)致內(nèi)毒素可以多種方式與溶液中的蛋白相互作用，形成復(fù)合物，大大增加去除的難度。
  層析純化利用內(nèi)毒素的不同性質(zhì)，可以采用離子交換層析，疏水層析，凝膠層析，復(fù)合層析等層析填料，降低和去除生物制品中的內(nèi)毒素。
 
1. 離子交換層析填料：
內(nèi)毒素分子的等電點PI在2左右，內(nèi)毒素在pH4~8的緩沖體系中帶大量負電荷。通常與陰離子交換填料的正電荷配基相結(jié)合，并在高濃度鹽時將其去除。而在pH4時，內(nèi)毒素還是帶負電荷，與陽離子交換填料不能結(jié)合，對于陽離子交換填料，可以的采用目標物結(jié)合而內(nèi)毒素流穿的方式，去除內(nèi)毒素。
 
因為非離子型去垢劑Triton X-100，Triton X-114和精氨酸，組氨酸等添加劑，有助于解離內(nèi)毒素與樣品分子的相互作用。所以，對于有些因內(nèi)毒素與樣品分子的相互作用，而在離子交換層析中內(nèi)毒素去除效果不好或者內(nèi)毒素濃度較高的生物制品中，可增加非離子型去垢劑和精氨酸，組氨酸等添加劑在淋洗步驟的緩沖液中，進行淋洗以降低生物制品洗脫液中的內(nèi)毒素含量。
 
百林科MaXtar^® Q HR層析填料，在某重組蛋白項目中，增加精氨酸淋洗工藝步驟，可以明顯降低生物制品中的內(nèi)毒素，如表1所示。  
 
2. 疏水層析填料
內(nèi)毒素的疏水特性，使得在高鹽濃度（大于1.5M 硫酸銨）時容易容易聚集，且聚集體與疏水填料不結(jié)合，而部分未聚集的內(nèi)毒素與填料結(jié)合緊密而不易洗脫，所以，上樣時聚集部分直接流穿而去除內(nèi)毒素，而未聚集部分保留較強（小于0.4~0.5M硫酸銨），可通過鹽梯度洗脫去除結(jié)合部分的內(nèi)毒素。
 
對于內(nèi)毒素與蛋白質(zhì)有相互作用的生物制品分離，添加非離子型去垢劑，精氨酸，組氨酸添加劑，有利于降低內(nèi)毒素與蛋白質(zhì)的相互作用，由于內(nèi)毒素與蛋白質(zhì)疏水性的不同，根據(jù)高鹽保留，低鹽洗脫的疏水特性，通過疏水層析梯度洗脫的形式，去除內(nèi)毒素。在上樣樣品添加1M精氨酸，降低內(nèi)毒素與蛋白質(zhì)的相互作用，達到去除內(nèi)毒素的目的。百林科MaXtar^® Butyl HR疏水填料，在某類病毒項目中去除內(nèi)毒素效果，如表2所示。  
3. 凝膠層析填料
內(nèi)毒素在一定成分的水溶液中可形成1000kDa分子量的聚集體，與蛋白分子的分子量相差較大，根據(jù)分子量大小使用凝膠層析分離，以去除內(nèi)毒素。

4. 復(fù)合層析填料
復(fù)合層析填料MaXtar^® MMA與MaXtar^® MMC填料具有靜電相互作用，氫鍵和疏水作用的等多功能性質(zhì)。復(fù)合層析的離子和疏水的雙重作用，在離子交換層析模式下，具有更寬的電荷結(jié)合和選擇范圍，蛋白質(zhì)需在一定濃度的鹽（0~0.5M NaCl）條件下上樣，能夠進行鹽梯度和pH雙梯度進行洗脫；而在疏水層析模式下較單一的疏水填料結(jié)合更牢固，對于去除內(nèi)毒素，增加了更多的選擇。
  對于內(nèi)毒素的去除，單一的層析方法可以達到本步的最優(yōu)效果，但是并不能達到生物制品的內(nèi)毒素的控制要求，通常需要多種層析工藝，進行聯(lián)用以去除去內(nèi)毒素的要求。
 
層析聯(lián)用去除內(nèi)毒素，應(yīng)根據(jù)內(nèi)毒素的性質(zhì)，結(jié)合層析方法選擇性，選擇合適的層析方法進行聯(lián)用。在某重組蛋白項目中，我們進行了工藝路線優(yōu)化，以四種層析方法聯(lián)用技術(shù)進行了純度和內(nèi)毒素的控制，每步層析在提高純度的基礎(chǔ)上，進一步進行內(nèi)毒素的去除，整個工藝為一體，系統(tǒng)的去除內(nèi)毒素，完成了各步的控制策略，結(jié)果見表3。 內(nèi)毒素是生物制品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，在層析純化過程中，對相關(guān)物料清潔方法，以控制和除去內(nèi)毒素：層析填料的清潔再生，一般使用0.5M NaOH+1~2 M NaCl進行CIP；
 
玻璃，塑料，硅膠管等管路或器皿上的內(nèi)毒素，選擇0.1~0.5M NaOH侵泡4h以上；玻璃和金屬制品，一般使用180℃加熱3~4h或者250℃加熱1~2h。

---