慢病毒下游工藝優(yōu)化策略

慢病毒載體（Lentivirus vector, LV）是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的一種包膜病毒，能夠穩(wěn)定整合在分裂和非分裂細胞中表達的轉(zhuǎn)基因，且包裝容量大、細胞毒性和免疫原性低、感染譜廣、可實現(xiàn)穩(wěn)定表達等優(yōu)勢，是當前基因治療和細胞療法廣泛使用的病毒載體之一。
 
慢病毒載體是一種有包膜的RNA病毒，直徑為80-120nm，呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)、球形，包裝容量一般為4.5~5kb；慢病毒的活性容易受生產(chǎn)工藝中的壓力，剪切力，溫度，鹽濃度，pH等影響。
 
下面從幾個核心步驟來介紹下慢病毒下游工藝開發(fā)策略：
慢病毒載體下游分離純化工藝基本上采用層析分離技術和中空纖維膜兩大技術。一般病毒載體純化層析會用到分子篩，復合模式和離子交換層析等多種層析方式；中空纖維技術包括澄清過濾，切向流過濾兩方面。
 
慢病毒純化基本流程及核心工藝步驟優(yōu)化點如下：

 
01 澄清收獲
澄清過濾主要是去除介質(zhì)中的細胞和細胞碎片及部分的HCD，HCP，并降低粘度。常用的方法為深層過濾，離心，死端過濾，或者其中兩種方法結(jié)合為主，但對于50L以上規(guī)模的慢病毒載體的澄清傾向于深層過濾或0.2~0.5μm中空纖維。
 
02 超濾濃縮 1
對澄清過濾溶液使用300~750KDa的中空纖維柱對慢病毒載體溶液濃縮換液，可以去除一部分的蛋白，DNA片段等雜質(zhì)分子。濃縮過程中一般控制剪切力為2000~4000/s-1,TMP為3~7psi，通量>50LMH，濃縮5-10倍。
 
03 核酸酶孵育
加入Benzonase核酸酶，降低DNA分子大小及粘度。核酸酶孵育一般溫度在在25～37℃，處理時間30～60 min；或溫度控制在2~8℃，過夜處理，核酸酶濃度在20-50 U/mL，Mg²⁺離子濃度在1‑10 mM。
 
04 層析純化
層析純化在慢病毒載體中占有重要地位，一般選擇MaXtar^® Q和兩步層析結(jié)合的方式，去除HCP，DNA片段及質(zhì)粒殘留等雜質(zhì)；MaXtar^® COLL 700（分子篩或多模式層析）層析對小于700KD的HCP，HCD及其他雜質(zhì)成分進入層析介質(zhì)基球的內(nèi)孔，通過離子相互作用疏水左右被保留，而大于700KD的慢病毒不進入內(nèi)孔流穿，從而實現(xiàn)分離；MaXtar^® Q以離子相互，與慢病毒載體結(jié)合，保留在MaXtar^® Q層析柱上，通過鹽梯度，去除工藝雜質(zhì)，收獲高活性的慢病毒載體。
 
由于慢病毒載體受壓力，剪切力，溫度，鹽濃度，pH等因素的影響易聚集，易失活，純化工藝中的一般工藝參數(shù)，在15~25℃溫度下層析條件優(yōu)化：MaXtar^® COLL 700/400 載量: 3~15CV，流速：150~300cm/h；MaXtar^® Q 載量：5~50CV，洗脫鹽濃度：0.5~0.8M NaCl，洗脫液要及時稀釋降低鹽濃度。
   
Case1：COLL 700 在慢病毒上的應用案例
 
 
Case2：COLL 700在慢病毒上的應用
 
   
05 超濾濃縮 2
對澄清過濾溶液使用300~750KDa的中空纖維柱對慢病毒載體溶液濃縮換液。濃縮過程中一般控制剪切力為2000~4000/s-1,TMP為3~7psi，濃縮慢病毒載體至合適的滴度和換液至制劑需要的緩沖液。
 
對于不同慢病毒載體可以選擇以下百林科的產(chǎn)品進行純化分離：  
 
 
以上幾款百林科層析介質(zhì)產(chǎn)品特點可匯總?cè)缦卤恚?/strong>  
 

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