單細(xì)胞技術(shù)解析人腦冷凍保存新技術(shù)，復(fù)活冷凍人腦類器官

編者按

近年來，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的出現(xiàn)使得研究者的視角從組織水平轉(zhuǎn)向細(xì)胞水平，而空間轉(zhuǎn)錄組能夠給出每一種細(xì)胞類型的空間位置信息，這兩種技術(shù)運(yùn)用也越來越廣泛，包括類器官研究領(lǐng)域。2024年5月13日，復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院邵志成研究員團(tuán)隊(duì)在 Cell Reports Methods 期刊發(fā)表了題為《Effective cryopreservation of human brain tissue and neural organoids》的研究論文。本文章使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)解析了冷凍保存和正常類器官中的細(xì)胞類型變化，更加有力的證明了冷凍技術(shù)的可行性。

Fig.1 類器官單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組/空間轉(zhuǎn)錄組研究思路

01 文章背景

研究腦部疾病新型藥物的人力和經(jīng)濟(jì)成本非常高，超過90%的腦部疾病候選新藥無法真正應(yīng)用到臨床中，其主要挑戰(zhàn)之一是將新藥從動(dòng)物模型試驗(yàn)轉(zhuǎn)向人源模型。隨著類器官技術(shù)的發(fā)展，腦類器官在研究人類大腦發(fā)育、模擬腦部疾病和開發(fā)新藥方面展現(xiàn)出了巨大的潛力。然而，需要長期培養(yǎng)的腦類器官由于成本和儲(chǔ)存問題極大的限制了其在生物醫(yī)藥研究中的應(yīng)用，可靠的類器官模型應(yīng)該具備新鮮人腦的自然病理特征。因此，開發(fā)出一種適用于腦類器官/腦組織的低溫保存方法對推動(dòng)腦科學(xué)基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化研究具有十分重要的意義。

 

02 文章詳情

文章題目：Effective cryopreservation of human brain tissue and neural organoids

中文題目：人類腦組織和神經(jīng)類器官有效凍存新技術(shù)

發(fā)表時(shí)間：2024.5

期刊名稱：Cell Reports Methods 

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：10x 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、類器官

DOI：10.1016/j.crmeth.2024.100777

 

03 研究內(nèi)容

1. 通過MEDY有效地低溫保存人體皮質(zhì)類器官

研究團(tuán)隊(duì)通過精準(zhǔn)控制冷凍介質(zhì)的成分和凍融過程開發(fā)了一種新型的低溫保存方法。選擇了多種具有維持類器官形態(tài)完整性、減少神經(jīng)元細(xì)胞死亡/保護(hù)軸突生長潛力的冷凍介質(zhì)的成分。并通過添加小分子抑制劑（Y27632）來提高類器官凍存的保護(hù)效果，然后通過對復(fù)蘇后類器官軸突生長狀態(tài)、神經(jīng)元生長狀態(tài)以及凋亡比例的對比分析，作者最終確定了1%甲基纖維素 + 10%乙二醇 + 10% DMSO + 10 μM Y27632 （MEDY）是腦類器官的最佳冷凍介質(zhì)。

Fig.2 不同冷凍保存介質(zhì)對復(fù)蘇后腦類器官的影響

2. MEDY能夠在低溫保存后維持皮質(zhì)類器官的功能活性和細(xì)胞多樣性

心室區(qū)（VZ）樣結(jié)構(gòu)和多個(gè)皮質(zhì)層在維持大腦類器官的功能方面發(fā)揮著重要作用，其功能結(jié)構(gòu)完好是發(fā)展低溫保存技術(shù)的關(guān)鍵問題。使用MEDY冷凍皮質(zhì)類器官，解凍后繼續(xù)培養(yǎng)21天、50天后，類器官功能結(jié)構(gòu)被完全保留，且在低溫保存1年半的類器官中祖細(xì)胞和神經(jīng)元依然能夠維持良好。通過對類器官進(jìn)行了bulk轉(zhuǎn)錄組測序和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序證明神經(jīng)標(biāo)志物的基因表達(dá)譜以及主要的神經(jīng)細(xì)胞亞群沒有明顯變化。然后通過鈣成像技術(shù)證明低溫保存的類器官仍具有功能性神經(jīng)元活性，其連通性得到了基本的保護(hù)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，MEDY超低溫保存不會(huì)破壞細(xì)胞群多樣性、基因表達(dá)、細(xì)胞空間位置分布以及功能活性。

Fig.3 MEDY保留腦類器官的功能結(jié)構(gòu)、細(xì)胞活性

3. 低溫保存的類器官的長期培養(yǎng)活性

低溫保存技術(shù)對長期培養(yǎng)的類器官具有重要的作用。因此作者將培養(yǎng)到77，90，100天以上的類器官使用MEDY冷凍保存，解凍后進(jìn)一步培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞依然能夠很好的維持，并且進(jìn)一步培養(yǎng)依然具有很強(qiáng)的鈣活性。這些結(jié)果表明，MEDY超低溫保存可以用于儲(chǔ)存長期培養(yǎng)的皮質(zhì)類器官。

Fig.4 MEDY超低溫保存可用于保護(hù)長期培養(yǎng)的皮質(zhì)類器官和SP類器官

4. MEDY低溫保存在多種腦區(qū)特異性類器官、腦組織中的應(yīng)用

使用MEDY培養(yǎng)基將誘導(dǎo)出的背/腹側(cè)前腦（GABA）類器官、脊髓（SP）類器官和視神經(jīng)（OVB）類器官培養(yǎng)至第30天左右進(jìn)行冷凍，免疫熒光染色結(jié)果標(biāo)明，這些腦區(qū)特異性類器官的細(xì)胞多樣性和結(jié)構(gòu)同樣得到了良好的保存，表明該培養(yǎng)基適用于福哦中腦區(qū)類器官的保存。進(jìn)一步在癲癇患者源性腦類器官以及3D腦組織進(jìn)行冷凍保存及驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其神經(jīng)元等細(xì)胞保存良好，并且保留了完成的病理結(jié)構(gòu)。說明MEDY可以應(yīng)用于腦類器官組織和活腦組織的冷凍保存。最后，研究團(tuán)隊(duì)通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MEDY通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑從而保護(hù)突觸功能，實(shí)現(xiàn)在低溫狀態(tài)下對腦類器官的保護(hù)作用。

Fig.5 MEDY低溫保存適用于保存癲癇兒童來源的皮質(zhì)類器官和活腦組織

總之，本研究找到了一種人類腦組織冷凍保存新方法，可以完成腦類器官、腦區(qū)域特異性類器官、癲癇患者源性腦類器官以及3D腦組織冷凍保存。對減少神經(jīng)類器官的制備時(shí)間和成本，實(shí)現(xiàn)各種神經(jīng)類器官和活體腦組織的大規(guī)模存儲(chǔ)提供可能性，并能夠有效促進(jìn)腦科學(xué)基礎(chǔ)研究、神經(jīng)類器官移植治療和藥物評(píng)估與篩選。

單細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于類器官培養(yǎng)后的驗(yàn)證，藥物治療機(jī)制，耐藥性研究中具有重要的地位，同年四月份在Cell reports發(fā)表的題為《Generation of human cerebral organoids with a structured outer subventricular zone》的研究論文，同樣使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究腦類器官對照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞類型和分子表達(dá)譜，為文章研究提供了更精細(xì)的分析角度。而單細(xì)胞分辨率的空間多組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，也許會(huì)為類器官的空間分布和原組織的相似性提供更多的驗(yàn)證手段。

類器官研究思路參考