細胞攻略：T84人結(jié)腸腺癌肺轉(zhuǎn)移細胞培養(yǎng)教程

--細 胞 基 本 信 息---
細胞名稱: T84(人結(jié)腸腺癌肺轉(zhuǎn)移細胞)
細胞別稱: T-84; T84
細胞貨號: SNL-456
生長特性: 貼壁
培養(yǎng)條件: DMEM+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境: 37℃；5% CO2；飽和濕度
細胞簡介： T84細胞是從一位72歲男性結(jié)腸癌患者的肺轉(zhuǎn)移灶獲得的腫瘤組織皮下接種于BALB/c裸鼠，并連續(xù)進行移植后建立的。在裸鼠身上的移植過程中，細胞株始終保持結(jié)腸癌的原始組織性狀，裸鼠傳代23代后建立了T84細胞。T84細胞有許多肽類激素和神經(jīng)遞質(zhì)的受體，并維持載體電解質(zhì)轉(zhuǎn)運。T84細胞單層生長到飽和，與相鄰細胞緊密連接并具有橋粒，角蛋白陽性。T84細胞可以用于3D細胞培養(yǎng)和癌癥研究。
 
T84細胞培養(yǎng)注意事項

• 呈島狀/片狀/塊狀生長

這是該細胞的特性，是正�，F(xiàn)象，并不是細胞發(fā)生“聚團”，無需擔心。細胞間連接緊密，在70%~80%密度時細胞實際數(shù)量其實比較大了，此時需要傳代。
   

• 消化時間較長

該細胞消化時間較長，參考時間約5-15min，接種時間越長/細胞密度越大，消化時間越長。不同品牌胰酶消化能力不一樣，根據(jù)具體情況調(diào)整（具體步驟見下文）。
 

• 貼壁較慢

該細胞傳代/復蘇后貼壁慢，大約需要48h貼壁，因此傳代/復蘇后建議48h后換液。
 

• 生長速度較慢

該細胞生長較慢，接種密度不可過低，推薦傳代比例1：2，傳代周期3-4天。
 

• 黑點較多

該細胞培養(yǎng)時背景中可能有黑點，為細胞代謝產(chǎn)物和細胞碎片，不影響細胞生長。若黑點較多可以通過PBS潤洗或換液清除
 

• 存在漂浮細胞

培養(yǎng)時存在部分漂浮的細胞是正�，F(xiàn)象，不影響細胞生長。漂浮細胞過多時可換液清除。
 
T84細胞傳代方法

• 準備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等；（試劑提前預熱）
• 抽走培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基，加5mL PBS潤洗1-2遍，清除殘留培養(yǎng)基；
• 盡量吸干潤洗的PBS后加1mL胰酶，搖晃使胰酶均勻覆蓋瓶底，放置培養(yǎng)箱37℃消化；
• 消化時每隔5 min拿出來觀察，部分細胞開始脫落時，吸取瓶中胰酶將細胞都吹下來，然后加入3-4mL含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻后立刻離心；

Tips：

• 細胞部分脫落后先用胰酶將細胞都吹下來再終止消化，避免細胞重新貼壁
• 變圓但未脫落時需要繼續(xù)消化，確保細胞是被胰酶消化下來而不是被強行吹下的

• 將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm，3min離心收集細胞；
• 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦15mL）
• 離心完成后，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細胞，將細胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，十字法或8字法混勻，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，注意培養(yǎng)瓶蓋透氣；

Tips：

• 全程注意控制吹打力度輕柔，吹打次數(shù)不可過多，避免機械損傷

 
T84細胞凍存方法

• 配制程序性凍存液，準備相應數(shù)量凍存管并做好標記。

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完全培養(yǎng)基+8%DMSO

• 先將細胞按傳代步驟消化、離心、棄上清，獲得細胞沉淀；
• 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細胞，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中；
• 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；
• 轉(zhuǎn)移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置

Tips：

• 液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存。
• 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。
• T25培養(yǎng)瓶長滿通�？蓛龃�2-3管，10cm皿長滿通�？蓛龃�3-4管。
• 凍存密度低將導致復蘇后細胞狀態(tài)不佳。

 
T84細胞復蘇方法

• 提前將水浴鍋預熱至37℃，培養(yǎng)基復溫至室溫或37℃，離心機設置好轉(zhuǎn)速；
• 將細胞從液氮罐中取出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴，融化過程不超過2min；

Tips：

• 若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。
• 凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮需靜置一會待液氮完全蒸發(fā)后再水浴。做好防護，避免凍存管炸開導致受傷。
• 水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。  
• 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機具體轉(zhuǎn)速會有差異
• 離心完成后棄上清，用預熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細胞后接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；
• 復蘇24小時后觀察細胞貼壁情況。

Tips：

• 整個細胞復蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。
• 該細胞貼壁需要穩(wěn)定的環(huán)境，復蘇完成后請勿頻繁將細胞拿出觀察。

 
T84細胞收貨攻略

• 常溫細胞

• 收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上；
• 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首次傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng)；

• 凍存細胞

• 細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完全揮發(fā)建議立即復蘇細胞并聯(lián)系銷售人員解決；
• 凍存細胞建議盡快復蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；
• 復蘇一管細胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術支持的指導下進行下一步操作；

Tips：

• 細胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完全揮發(fā)等異常情況時，及時拍照聯(lián)系銷售人員；
• 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內(nèi)含對應細胞的完全培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細胞培養(yǎng)；

 
常見問題及解決方案
NO.1細胞密度怎么計算的？
嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數(shù)細胞數(shù)量，但在實際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細胞數(shù)量而消化細胞計數(shù)。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀、簡便的表現(xiàn)細胞狀態(tài)的一種方式。
 
NO.2培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理？
1. 細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別，細胞培養(yǎng)體系不適應、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5mL PBS重懸細胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
 
NO.3細胞具體消化時間是多久？
每個實驗室用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完全規(guī)定消化時間，以實際消化效果和實驗經(jīng)驗為準。 
 
 
產(chǎn)品：
【SNL-456】 T84 (人正常乳腺上皮細胞)
【SNLM-456】T84細胞專用完全培養(yǎng)基