常見(jiàn)VLPs疫苗的工藝路線簡(jiǎn)介

病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)疫苗是指具有類似于天然病毒粒子空間結(jié)構(gòu)的多聚體顆粒的一類疫苗，其含有某種病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，沒(méi)有病毒核酸，不能自主復(fù)制，在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似。VLPs雖然具有病毒的天然形式和大小，但缺乏遺傳物質(zhì)，不能自我復(fù)制，不具有致病性和傳染性，因此安全性強(qiáng)且免疫原性高，可用于開(kāi)發(fā)抗病毒疫苗。

VLPs的概念源于1980年代在乙型肝炎(Hepatitis B Virus, HBV)患者血液中發(fā)現(xiàn)的亞病毒顆粒。當(dāng)施用于健康個(gè)體時(shí)，這些血漿來(lái)源的亞病毒顆粒提供了對(duì)HBV的保護(hù)，從而產(chǎn)生了第一種基于VLPs的疫苗。 為滿足VLPs疫苗的商品化生產(chǎn)，工藝的可重復(fù)性、成本、產(chǎn)能和安全性，表達(dá)系統(tǒng)在VLPs疫苗生產(chǎn)過(guò)程中就顯得非常重要，不同的表達(dá)系統(tǒng)可能影響VLPs的生產(chǎn)效率和質(zhì)量。目前，已開(kāi)發(fā)出幾種用于VLPs疫苗生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)，包括細(xì)菌（如大腸桿菌）、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。生產(chǎn)放大中，常用的為大腸桿菌和酵母兩種表達(dá)體系。其中，大腸桿菌表達(dá)平臺(tái)成本低、產(chǎn)量高，適用于簡(jiǎn)單VLPs的生產(chǎn)，在修飾方面稍顯不足。酵母表達(dá)系統(tǒng)則生長(zhǎng)迅速、成本低廉，能提供一定程度的翻譯后修飾，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。目前已報(bào)導(dǎo)的VLPs疫苗約70％基于真核表達(dá)系統(tǒng)，30％基于原核表達(dá)系統(tǒng)。
 
對(duì)于幾種已經(jīng)獲批的VLPs疫苗，HBsAg VLPs采用了酵母或CHO細(xì)胞；人乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus, HPV) VLPs采用釀酒酵母(Gardasil)或昆蟲(chóng)細(xì)胞(Cervarix)；而戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV) VLPs疫苗Hecolin采用大腸桿菌表達(dá)，并體外組裝。此外，無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也已成功應(yīng)用在VLPs的表達(dá)上。

  從結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，VLPs可以分為無(wú)包膜VLPs與有包膜VLPs。VLPs疫苗甚至可構(gòu)建雙層、三層包膜，實(shí)現(xiàn)多價(jià)疫苗與多聯(lián)疫苗的效果。無(wú)包膜的VLPs疫苗只包含由病毒的蛋白形成的顆粒，如HPV、HEV等疫苗，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，一般由原核表達(dá)系統(tǒng)和低級(jí)真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。而有包膜VLPs結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需要宿主的細(xì)胞膜參與構(gòu)建，比如A型流感病毒和乙型肝炎病毒，一般由真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。   目前，幾種基于VLPs的疫苗已經(jīng)上市，包括預(yù)防乙型肝炎病毒(HBV)的Recombivax HB和Engerix-B，預(yù)防人乳頭瘤病毒(HPV)的Gardasil， Cervarix和Gardasil-9，以及應(yīng)用于預(yù)防戊型肝炎病毒(HEV)的Hecolin等。   「HBV乙型肝炎病毒疫苗」
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)是乙型肝炎的主要病原，屬于包膜DNA病毒，包含由脂質(zhì)和三種包膜蛋白組成的外膜。目前，疫苗接種是預(yù)防HBV感染最有效的方法。
 
「HPV人乳頭瘤病毒疫苗」
宮頸癌是全球女性癌癥死亡的第二大常見(jiàn)原因，全世界約70%的宮頸癌由高危HPV亞型16和18導(dǎo)致，四價(jià)Gardasil(MSD)是第一個(gè)被批準(zhǔn)作為人乳頭瘤病毒(HPV)預(yù)防性的疫苗。在酵母中表達(dá)得到的重組蛋白L1自組裝成VLPs，主要為HPV 6/11/16/18這四種HPV類型引起的病毒感染提供保護(hù)。
 
「HEV戊型肝炎病毒疫苗」
HEV是一種非包膜單鏈RNA病毒，其基因組包含3個(gè)開(kāi)放閱讀框，ORF2編碼唯一的結(jié)構(gòu)蛋白。廈門萬(wàn)泰生物技術(shù)有限公司研制的基于截?cái)嗟膒ORF2的HEV239 (Hecolin)于2012年在中國(guó)獲批，該疫苗由大腸桿菌表達(dá)，是全球首個(gè)且唯一的戊肝疫苗。

  「動(dòng)物VLPs疫苗」
口蹄疫疫苗、小反芻獸疫疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征疫苗、豬圓環(huán)病毒疫苗（Ⅱ型）、豬細(xì)小病毒疫苗、高致病性禽流感疫苗、新城疫疫苗、裂谷熱疫苗、藍(lán)舌病毒疫苗等。
 
「人用VLPs疫苗」
人用VLPs疫苗，有很多有現(xiàn)役疫苗，是因?yàn)榛�于基因工程重組蛋白構(gòu)建VLPs，可以完全人工設(shè)計(jì)、能對(duì)VLPs進(jìn)行多種修飾滿足不同需求，其免疫原性和安全性的可控程度高。例如，手足口疫苗（EV71病毒）、手足口2價(jià)疫苗（EV71病毒+CA16病毒）、呼吸道合胞病毒疫苗、諾如病毒疫苗、埃博拉疫苗、流感疫苗、基孔肯雅病毒疫苗、艾滋病疫苗、瘧疾疫苗等。

  純化包括粗純、中間純化及精純等階段。色譜法是VLPs下游工藝的核心操作單元，包括親和層析、離子層析、疏水層析、分子篩層析以及復(fù)合模式層析。

   
國(guó)內(nèi)乙肝疫苗有兩種表達(dá)方式，分別是CHO細(xì)胞、酵母。酵母細(xì)胞在制備HBsAg時(shí)多為胞內(nèi)表達(dá)，需收獲裂解后澄清，疏水捕獲（HBsAg蛋白的疏水鍵可與疏水配基結(jié)合），流穿模式下陰離子去除大量HCP等雜質(zhì)，分子篩精純?nèi)コ�小分子雜質(zhì)。而CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)多為胞外表達(dá)，料液中含少量HCP，無(wú)需裂解過(guò)程。CHO含糖基化HBsAg，更接近天然結(jié)構(gòu)，純化過(guò)程與酵母表達(dá)系統(tǒng)相比簡(jiǎn)單，可在粗純階段選擇疏水作用相對(duì)較弱的填料。
 
推薦百林科MaXtar^® 系列HIC，IEX填料，以高剛性瓊脂糖為基架偶聯(lián)相對(duì)應(yīng)的疏水基團(tuán)，反壓低、流速快，適合生物分子的大規(guī)模分離純化。

 
上市HPV疫苗源于大腸桿菌、酵母以及桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞三種表達(dá)系統(tǒng)。
 
百林科MaXtar^® S HC，基架具有更強(qiáng)剛性，在較低反壓下能夠?qū)崿F(xiàn)更高工藝流速，提高工藝效率。在保證分離效果的同時(shí)，兼具高動(dòng)態(tài)載量。在捕獲階段提供更快速,更高效的分離純化選擇。后續(xù)通過(guò)羥基磷灰石(BARONHAP™) 、離子或疏水層析進(jìn)行精純。
 
多模式層析因?yàn)槟芡瑫r(shí)提供不同類型的相互作用力，所以也多用在 VLPs 純化工藝開(kāi)發(fā)中。百林科MaXtar^® COLL 400和700是新型的多模式層析介質(zhì)，分子量排阻分別為400KD和700KD，它由兩層不同的結(jié)構(gòu)組成。外殼是多孔的鈍化層，小于對(duì)應(yīng)分子量的雜質(zhì)進(jìn)入微球內(nèi)部與配基基團(tuán)結(jié)合。大于對(duì)應(yīng)分子量的大分子不會(huì)進(jìn)孔，直接走外水流穿；核心是偶聯(lián)了同時(shí)具有疏水和電荷吸附作用基團(tuán)的球形內(nèi)核，最大程度結(jié)合宿主蛋白、核酸等雜質(zhì)。該層析介質(zhì)能很好的用于多種大分子生物樣本的分離純化，是疫苗生產(chǎn)中病毒純化介質(zhì)的極佳選擇。

 
案例1—口蹄疫VLPs：  
Ni Chromstar^® Excel 在本次試驗(yàn)中，樣品加入0.1% 吐溫20和1 mM DTT，且在上樣時(shí)添加20 mM 咪唑，洗脫后洗脫液純度較高，且介質(zhì)載量為4.63 mg/mL。

 
案例2—EV71病毒：
EV71 疫苗，三步層析分別用百林科Chromstar^® 6FF，Q Chromstar^® XL，Puredex^® G-25M 填料進(jìn)行小試試驗(yàn)。
本次小試三批 Scale down 完全按照生產(chǎn)批工藝進(jìn)行。從實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)可知，檢測(cè)的所有項(xiàng)目均符合其檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)與生產(chǎn)批檢測(cè)結(jié)果相比沒(méi)有明顯差異， 達(dá)到了平替三步層析填料的效果。 從層析圖譜上可知，小試三批圖譜峰型基本一致，批間穩(wěn)定性較好。與生產(chǎn)批層析圖譜基本一致，跟目前的商業(yè)化規(guī)模圖譜具有可比性。


參考文獻(xiàn)：
[1] Cervera L, Gòdia F, Tarrés-Freixas F, Aguila-Gurrieri C, Carrillo J, Blanco J, Gutiérrez-Granados S. Production of HIV-1-based virus-like particles for vaccination: achievements and limits. Appl Microbiol Biotechnol. 2019 Sep;103(18):7367-7384. 

 

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