深度梳理CAR療法：從CAR-T、CAR-NK到CAR-M的難點與解決策略
嵌合抗原免疫受體（CAR）療法的發(fā)展已有一定歲月，在過去的一二十年間，它已悄然改變惡性腫瘤的治療版圖，也將迎來其廣闊的發(fā)展前景和未來。今天小編就將對CAR-T，CAR-NK, CAR-M這幾種CAR療法展開討論，討論它們各自的優(yōu)勢以及局限性。
近年來，免疫療法作為繼外科切除術(shù)，放射性療法，化療之后治療惡性腫瘤的第四大基石持續(xù)并且高速發(fā)展�，F(xiàn)今取得巨大成功的免疫療法主要包括免疫檢查點抑制劑（ICIs）和CAR過繼細胞療法。
相較ICI療法在多靶點，多適應(yīng)癥的獲批上，目前僅有六種CAR-T療法獲得FDA準(zhǔn)許用于B細胞來源的血液系統(tǒng)腫瘤，略顯力絀。而CAR-T用于治療實體瘤的大門也尚未完全打開，亟待探索。
1. 何為CAR結(jié)構(gòu)？
無論是CAR-T，CAR-NK，CAR-M都有相似的CAR結(jié)構(gòu)，CAR是一種通過基因工程合成的細胞表面受體，由抗原結(jié)合區(qū)，鉸鏈區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)組成。
抗原結(jié)合區(qū)可以識別腫瘤相關(guān)抗原（TAA），決定了治療的靶向性。
鉸鏈區(qū)是一段將抗原結(jié)合區(qū)暴露給靶標(biāo)抗原的間隔區(qū)域，它的長短通常都是由靶標(biāo)抗原的位置決定的。
跨膜區(qū)的主要功能是將CAR定位在免疫細胞膜上。
細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)是研究最廣泛的領(lǐng)域，是影響CAR免疫細胞抗腫瘤活性的關(guān)鍵。基于對該區(qū)域的研究和改進，產(chǎn)生了三代CAR結(jié)構(gòu)。第一代CAR結(jié)構(gòu)僅僅擁有一個CD3ζ信號區(qū)域，而T細胞的活化不僅需要TCR-CD3的激活，也需要共刺激信號CD28的激活，所以這限制了第一代CAR-T的抗腫瘤活性和在體內(nèi)的存續(xù)性。二代三代CAR結(jié)構(gòu)則在此基礎(chǔ)上，增加了CD28或者4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域，甚至對某些共刺激域進行組合以達到更好的抗腫瘤效果。實驗證實，擁有DAP10和CD27兩種共刺激域的CAR-T細胞在體內(nèi)具有最佳抗腫瘤效果。
圖1：三代CAR結(jié)構(gòu)（來源：資料一）
近年來發(fā)現(xiàn)，除了對信號傳導(dǎo)區(qū)的設(shè)計和改造外，一些修飾也有助于提高抗腫瘤效應(yīng)，弱化治療毒性。例如表達趨化因子受體的CAR-T細胞更易浸潤至腫瘤微環(huán)境（TME）；雙靶點T細胞可以靶向兩處腫瘤抗原來避免免疫逃逸的發(fā)生。
2. 奠基之石：CAR-T
治療現(xiàn)狀
目前通過FDA審批的六種CAR-T藥物均靶向B細胞表面marker，其中有四種靶向CD19，用于復(fù)發(fā)難治性B細胞急性淋巴細胞白血病（ALL-B）、大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤或套細胞淋巴瘤治療，而靶向B細胞成熟抗原（BCMA）的兩款藥物則是用于多發(fā)性骨髓瘤（MM）的治療。今年3月1日，F(xiàn)DA也正式批準(zhǔn)了傳奇生物的CAR-T產(chǎn)品，西達基奧侖賽(cilta-cel)，用于治療復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤患者。這也是首款獲得FDA批準(zhǔn)的國產(chǎn)CAR-T細胞療法。NMPA也批準(zhǔn)了阿基侖賽注射液和奧基倫賽注射液兩款CAR-T藥物的上市。除此之外，有超過700項針對不同癌種的CAR-T臨床試驗正在全界范圍內(nèi)展開。
CAR-T在實體腫瘤中應(yīng)用的難點與解決策略
難點一：靶點的選擇
幾乎所有應(yīng)用于實體腫瘤CAR-T療法的靶點在正常細胞上均有表達。盡管在血液腫瘤的治療上也有此弊端，但因其對被損傷的正常細胞有挽救性糾正辦法（免疫球蛋白可以補充靶向B細胞CAR-T治療后機體功能的損失），以及血細胞本身快速的再生能力，on target-off tumor 效應(yīng)在血液腫瘤中得以很好的控制。而實體腫瘤卻不具備上述優(yōu)勢，CAR-T治療容易對機體造成毀滅性的打擊，且沒有很好的解救方案。
策略：
i. Spilt-and策略�？梢詫⒊跏夹盘栍蚝凸泊碳ば盘栍虿鸱种羶煞NCAR中，使CAR-T細胞只被擁有兩種TAA的細胞激活，減少誤傷。
ii. And-not策略。使CAR-T細胞在識別到某種正常組織上的marker之時，停止激活。
難點二：腫瘤抗原異質(zhì)性
策略：
i. 選用雙或者多特異性CAR，靶向不同抗原。
ii. 制備裝配不同類型CAR的T細胞，靶向不同抗原。
難點三：CAR-T難以浸潤至腫瘤內(nèi)部或功能受到腫瘤免疫抑制TME的影響
策略：
i. 針對不同腫瘤細胞趨化因子的表達分泌情況，在CAR-T上裝備在靶細胞上調(diào)趨化因子的受體，提高T細胞浸潤能力。
ii. 敲除CAR-T的TGF-β基因，減少免疫抑制水平，提高其抗腫瘤活性。
圖2：CAR-T的局限性（來源于資料二）
3. 前進之路：CAR-NK
在CAR-T的研究如火如荼之時，CAR-NK的開發(fā)也逐漸成為熱點。作為固有免疫系統(tǒng)中的一分子，NK細胞識別靶細胞并不需要MHC的提呈，而是直接與靶細胞結(jié)合發(fā)揮殺傷功能。不僅如此，因為細胞因子表達譜的差異，NK細胞的活化過程不會引起CRS，這也使得CAR-NK的開發(fā)具有其特別的意義和廣闊的未來。
相較于CAR-T的優(yōu)勢
就免疫細胞的來源來說，CAR-T治療由于同種異體反應(yīng)以及移植物抗宿主�。℅VHD），往往只能選擇自體T細胞。然而大部分接受CAR-T治療的病人都已經(jīng)經(jīng)歷過一線或者二線的治療，很多病人的外周血中T細胞水平很低，自體T細胞的收集時間過長可能會延誤治療時機。而NK細胞的活化并非通過MHC途徑，則即使選用異體NK細胞，也可以避免GVDH。NK-92細胞系，臍帶血或是誘導(dǎo)多能干細胞等現(xiàn)成的細胞系都能成為免疫細胞的來源，并且可以批量化生產(chǎn)，防止延誤治療時機的慘劇出現(xiàn)。
就毒性反應(yīng)來說，CAR-NK造成CRS和神經(jīng)毒性的概率非常低，這與CAR-T的CRS高發(fā)生率有顯著差異。
就發(fā)揮殺傷作用的途徑來說，NK細胞既可以通過CAR途徑，也可以通過非CAR途徑殺傷腫瘤細胞。例如阻斷NK細胞表面的負性調(diào)節(jié)因子殺手免疫球蛋白樣受體（KIRs）提高NK細胞的活性，或是利用ADCC效應(yīng)殺傷腫瘤細胞。
就生命周期來說，NK細胞在體內(nèi)大約只有兩周的壽命。這顯然是一把雙刃劍，因為雖然它減輕了CAR-NK療法的on target- off tumor毒性，但如果想要達到持續(xù)的緩解狀態(tài)，就需要反復(fù)輸注。
圖3: NK細胞進行癌癥免疫治療的四種途徑
（來源于資料一）
局限性
CAR-T治療中所遇到的某些挑戰(zhàn)在CAR-NK治療中同樣存在，例如靶點的篩選，抗原的異質(zhì)性，CAR的設(shè)計以及NK細胞在腫瘤中的轉(zhuǎn)運和浸潤困難等問題。
另外值得重視的問題是如何優(yōu)化CAR-NK細胞的制備和儲存工藝，更好地發(fā)揮其常備性優(yōu)勢。
除此之外，NK細胞較短半衰期所造成的反復(fù)輸注CAR-NK細胞以維持長期緩解的現(xiàn)狀為治療造成了不小的挑戰(zhàn)。
腫瘤細胞所表達的MHC分子可與NK細胞表面抑制性KIRs結(jié)合抑制NK細胞的抗腫瘤活性。
4. 未來之星：CAR-M
雖然CAR-T在血液系統(tǒng)的惡性腫瘤中取得了巨大的成功，但我們卻還沒有在實體瘤的治療上看到明確療效。CAR-NK雖然可以克服CAR-T療法的一些缺點，但也仍然在實體瘤的應(yīng)用上有很大局限性。而因巨噬細胞作為腫瘤微環(huán)境中占比最多的免疫細胞，CAR-M相比于CAR-T和CAR-NK具有以下幾點優(yōu)勢：
免疫細胞在腫瘤微環(huán)境中的轉(zhuǎn)運和浸潤提高。缺氧環(huán)境下，腫瘤組織分泌的許多細胞因子（CCL2，CXCL12，CSF1和VEGF）都可以募集巨噬細胞，而一旦巨噬細胞進入腫瘤微環(huán)境，這些細胞因子在巨噬細胞上的受體隨即下調(diào)，將巨噬細胞牢牢鎖在腫瘤TME之中。
在免疫抑制微環(huán)境中強大的吞噬能力。大部分的實體瘤作為“免疫冷”腫瘤會排斥具有免疫殺傷功能的細胞進入TME，即使少部分進入TME的T細胞也總是呈現(xiàn)出活性缺失的狀態(tài)。而腫瘤微環(huán)境中的M1型（抗炎型）和M2型（抑炎型）都具有強大的吞噬能力，且其表型的高度可塑性也使M1和M2表型的相互轉(zhuǎn)化成為可能。
巨噬細胞在發(fā)揮吞噬作用的同時，作為抗原提呈細胞，進一步提高CAR-M的抗腫瘤活性。
盡管CAR-M在免疫治療領(lǐng)域具有巨大的潛能，但目前的CAR-M研究大多處于臨床前階段，只有一項靶向HER2過表達實體瘤的自體CAR-M研究處于Ⅰ期臨床階段，而CAR-M的研究主要集中在通過優(yōu)化CAR結(jié)構(gòu)活化和提高CAR-M吞噬靶細胞的功能。
圖4：CAR-M的研究現(xiàn)狀
總結(jié)與展望
CAR-T療法在血液腫瘤中取得巨大成就的同時，也因為腫瘤特異性抗原的缺乏，CAR-T細胞難以轉(zhuǎn)運和遷移至腫瘤組織內(nèi)部以及免疫抑制性TME而難以在實體腫瘤的治療上發(fā)揮作用。
相比于CAR-T , CAR-NK較短的生命周期減弱了 on target-off tumor毒性，不同的細胞因子表達譜降低了CRS和神經(jīng)毒性發(fā)生的風(fēng)險，NK細胞非MHC途徑識別靶細胞的特性使異體CAR-NK發(fā)生GVHD的可能性降低。盡管如此，CAR-T所面臨的主要挑戰(zhàn)在CAR-NK上還是沒有得到有效的解決。
巨噬細胞作為TME中主要的免疫細胞，既有強大的吞噬功能，又有抗原提呈的作用以及高度的可塑性，在提高CAR免疫細胞腫瘤浸潤以及克服腫瘤免疫抑制TME這兩方面有很大發(fā)展?jié)摿�，這也在Klichinsky實驗室進行的一項靶向HER2過表達的實體腫瘤CAR-M試驗中得以印證。
CAR免疫細胞療法已然成為抗腫瘤治療的重點領(lǐng)域。盡管挑戰(zhàn)重重，科學(xué)家們?nèi)匀荒贸隽艘粋�又一個的應(yīng)對策略。在血液學(xué)領(lǐng)域高歌猛進的同時，科學(xué)家們也正努力讓CAR在實體瘤的治療上占據(jù)一席之地。CAR治療的發(fā)展也將側(cè)重于尋找適宜的腫瘤特異性抗原，根據(jù)免疫細胞的類型改造CAR結(jié)構(gòu)，減毒策略，鑒別適用于裝配CAR結(jié)構(gòu)的免疫細胞，以及控制CAR免疫細胞在體內(nèi)發(fā)揮作用的時間和效力，努力使CAR細胞療法成為更為有效，安全的抗癌方案。
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