動(dòng)物活體成像之生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)技巧及注意事項(xiàng)
通過上期的介紹，我們已經(jīng)知道，生物發(fā)光和熒光作為最常見兩種光學(xué)成像技術(shù)，各有特點(diǎn)。其中生物發(fā)光技術(shù)因其背景噪音低，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤，分子互作及信號(hào)傳導(dǎo)等研究中得到了廣泛應(yīng)用。當(dāng)兩種方法都適用于研究對(duì)象時(shí)，更推薦用生物發(fā)光標(biāo)記方法開展成像實(shí)驗(yàn)。
一個(gè)完整的生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)流程，至少應(yīng)包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（選擇合適的熒光素酶報(bào)告基因和熒光素底物）、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染（將熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，使其表達(dá)熒光素酶）、動(dòng)物模型準(zhǔn)備（選擇適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，并根據(jù)需要進(jìn)行基因編輯或誘導(dǎo)特定病理狀態(tài)）、細(xì)胞注射或移植（將標(biāo)記細(xì)胞注射或移植到動(dòng)物模型中）、熒光素底物注射（在成像前向動(dòng)物注射底物，可通過腹腔注射、靜脈注射或口服等方式）、成像觀察（使用高靈敏度的活體成像系統(tǒng)，在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)捕捉生物發(fā)光信號(hào)）等。
本期，我們將深入探討生物發(fā)光活體成像系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)技巧，從熒光素的選擇到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，逐一探討生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)及技巧。
熒光素的選擇
熒光素酶與熒光素的化學(xué)反應(yīng)是生物發(fā)光的基礎(chǔ)，選擇合適的發(fā)光酶和底物是實(shí)驗(yàn)成功的第一步。生物發(fā)光活體成像系統(tǒng)常用的發(fā)光酶包括螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶等。實(shí)驗(yàn)一般選用螢火蟲螢光素酶，有時(shí)也會(huì)用海腎螢光素酶。
二者區(qū)別如下表所示：
體外驗(yàn)證
將構(gòu)建的細(xì)胞加入150μg/ml D-luciferin 底物溶液2分鐘后使用IVScope小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀測(cè)，然后進(jìn)行生物發(fā)光的定量分析。
計(jì)算單個(gè)細(xì)胞單位時(shí)間發(fā)出的光子數(shù)，當(dāng)數(shù)值大于100時(shí)，適合進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，數(shù)值過低或過高，都不適合體內(nèi)成像或長(zhǎng)期觀測(cè)。將定量數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，線性好證明細(xì)胞表達(dá)穩(wěn)定，線性差則表明熒光素酶表達(dá)不穩(wěn)定，同樣不適合進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞接種
確保細(xì)胞是在良好的生長(zhǎng)狀態(tài)下，并且已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)錄了熒光素酶基因。在接種前，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。接種部位和數(shù)量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整，將細(xì)胞接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)。確保細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)、擴(kuò)散，以產(chǎn)生穩(wěn)定的發(fā)光信號(hào)。
熒光素底物注射
將螢光素或其它底物注射入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)。實(shí)驗(yàn)總結(jié)出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。注射方式有靜脈注射、腹腔注射、鼻吸（i.n.）或其他方式。
腹腔注射（i.p.）：腹腔注射擴(kuò)散較慢，持續(xù)發(fā)光長(zhǎng)。
靜脈注射（i.v.）：血液運(yùn)輸，靈敏度高，重復(fù)性好。信號(hào)來的快，去的也快
鼻吸（i.n.）：適合于肺部成像
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛣?dòng)物模型的特點(diǎn)，選擇合適的注射方式。注射時(shí)，需注意注射速度、劑量和濃度，以確保發(fā)光信號(hào)在體內(nèi)均勻分布。
體內(nèi)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳成像條件
在正式實(shí)驗(yàn)前，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定發(fā)光時(shí)間線和最佳拍攝時(shí)間。一般情況下，腹腔注射底物約一分鐘后表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞開始發(fā)光，十分鐘后強(qiáng)度達(dá)到最高。在最高點(diǎn)持續(xù)約20-30分鐘后開始衰落，約三小時(shí)后發(fā)光全部消失。所以最好的檢測(cè)時(shí)間是在注射后15-35分鐘內(nèi)。
成像設(shè)備的選擇
在生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)中，合適的儀器對(duì)確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。
理想的成像儀器應(yīng)具備以下特點(diǎn)：
1. 高靈敏度
選擇具有高靈敏度的儀器，以便檢測(cè)低水平的信號(hào)，這對(duì)于早期疾病檢測(cè)和微小變化的監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。
2. 高分辨率
考慮儀器的動(dòng)態(tài)范圍和分辨率，高分辨率儀器能夠提供更清晰的圖像，有助于更精確地定位和量化生物學(xué)過程。
3. 寬動(dòng)態(tài)范圍
儀器應(yīng)具有寬廣的動(dòng)態(tài)范圍，能夠同時(shí)檢測(cè)到從低到高的信號(hào)強(qiáng)度。以保證在不同條件下都能獲得清晰的信號(hào)和高質(zhì)量的圖像。儀器的背景噪聲應(yīng)盡可能低，以提高信噪比。
4. 操作便利性、環(huán)境適應(yīng)性及樣本兼容性
選擇用戶界面友好、易于操作的設(shè)備，且能夠適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)條件和樣本類型�？紤]儀器與其他實(shí)驗(yàn)設(shè)備的兼容性，以及未來升級(jí)或添加新功能的潛力。
5. 良好的技術(shù)支持和服務(wù)
確保在遇到操作或技術(shù)問題時(shí)能夠得到及時(shí)有效的幫助。綜合這些因素，選擇適合的生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)儀器，將有助于提高實(shí)驗(yàn)的成功率和數(shù)據(jù)的質(zhì)量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀和分析
獲取高質(zhì)量的成像數(shù)據(jù)只是研究的一部分，結(jié)果的判讀與數(shù)據(jù)分析同樣重要。它能幫助研究人員從圖像中提取有價(jià)值的信息，并得出科學(xué)結(jié)論。
1. 圖像優(yōu)化處理：采用軟件對(duì)拍攝到的圖像進(jìn)行優(yōu)化處理、灰度調(diào)節(jié)、偽彩色處理等，以提高圖像質(zhì)量。
2. 定義感興趣區(qū)域（ROI）：計(jì)算發(fā)光強(qiáng)度、發(fā)光面積、發(fā)光信號(hào)變化等參數(shù)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果�？墒褂媒y(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以得出有意義的結(jié)論。
3. 多圖分析：不同時(shí)間點(diǎn)成像結(jié)果的分析要用到多圖分析，數(shù)據(jù)歸一化有助于消除偏差，批量ROI圈選及計(jì)算，生成動(dòng)力學(xué)曲線、批量導(dǎo)出圖片及動(dòng)態(tài)展示等提高了結(jié)果的可讀性和理解性。
結(jié)論
綜上所述，生物發(fā)光活體成像在實(shí)驗(yàn)過程中涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，掌握各個(gè)方面的技巧和方法對(duì)于獲得可靠、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。
一個(gè)完整的生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)流程，至少應(yīng)包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（選擇合適的熒光素酶報(bào)告基因和熒光素底物）、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染（將熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，使其表達(dá)熒光素酶）、動(dòng)物模型準(zhǔn)備（選擇適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，并根據(jù)需要進(jìn)行基因編輯或誘導(dǎo)特定病理狀態(tài)）、細(xì)胞注射或移植（將標(biāo)記細(xì)胞注射或移植到動(dòng)物模型中）、熒光素底物注射（在成像前向動(dòng)物注射底物，可通過腹腔注射、靜脈注射或口服等方式）、成像觀察（使用高靈敏度的活體成像系統(tǒng)，在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)捕捉生物發(fā)光信號(hào)）等。
本期，我們將深入探討生物發(fā)光活體成像系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)技巧，從熒光素的選擇到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，逐一探討生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)及技巧。
熒光素的選擇
熒光素酶與熒光素的化學(xué)反應(yīng)是生物發(fā)光的基礎(chǔ)，選擇合適的發(fā)光酶和底物是實(shí)驗(yàn)成功的第一步。生物發(fā)光活體成像系統(tǒng)常用的發(fā)光酶包括螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶等。實(shí)驗(yàn)一般選用螢火蟲螢光素酶，有時(shí)也會(huì)用海腎螢光素酶。
二者區(qū)別如下表所示：
體外驗(yàn)證
將構(gòu)建的細(xì)胞加入150μg/ml D-luciferin 底物溶液2分鐘后使用IVScope小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀測(cè)，然后進(jìn)行生物發(fā)光的定量分析。
計(jì)算單個(gè)細(xì)胞單位時(shí)間發(fā)出的光子數(shù)，當(dāng)數(shù)值大于100時(shí)，適合進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，數(shù)值過低或過高，都不適合體內(nèi)成像或長(zhǎng)期觀測(cè)。將定量數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，線性好證明細(xì)胞表達(dá)穩(wěn)定，線性差則表明熒光素酶表達(dá)不穩(wěn)定，同樣不適合進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞接種
確保細(xì)胞是在良好的生長(zhǎng)狀態(tài)下，并且已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)錄了熒光素酶基因。在接種前，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。接種部位和數(shù)量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整，將細(xì)胞接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)。確保細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)、擴(kuò)散，以產(chǎn)生穩(wěn)定的發(fā)光信號(hào)。
熒光素底物注射
將螢光素或其它底物注射入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)。實(shí)驗(yàn)總結(jié)出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。注射方式有靜脈注射、腹腔注射、鼻吸（i.n.）或其他方式。
腹腔注射（i.p.）：腹腔注射擴(kuò)散較慢，持續(xù)發(fā)光長(zhǎng)。
靜脈注射（i.v.）：血液運(yùn)輸，靈敏度高，重復(fù)性好。信號(hào)來的快，去的也快
鼻吸（i.n.）：適合于肺部成像
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛣?dòng)物模型的特點(diǎn)，選擇合適的注射方式。注射時(shí)，需注意注射速度、劑量和濃度，以確保發(fā)光信號(hào)在體內(nèi)均勻分布。
體內(nèi)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳成像條件
在正式實(shí)驗(yàn)前，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定發(fā)光時(shí)間線和最佳拍攝時(shí)間。一般情況下，腹腔注射底物約一分鐘后表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞開始發(fā)光，十分鐘后強(qiáng)度達(dá)到最高。在最高點(diǎn)持續(xù)約20-30分鐘后開始衰落，約三小時(shí)后發(fā)光全部消失。所以最好的檢測(cè)時(shí)間是在注射后15-35分鐘內(nèi)。
麻醉方法
為減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在成像過程中的運(yùn)動(dòng)干擾，需對(duì)其進(jìn)行麻醉。選擇合適的麻醉藥物和劑量，確保動(dòng)物在成像過程中處于穩(wěn)定狀態(tài)，保證獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，又能最大限度地保障動(dòng)物福利，確保其安全。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般較難合作，因此實(shí)驗(yàn)中常采用全身麻醉，根據(jù)麻醉方式分為吸入麻醉和非吸入麻醉。
為減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在成像過程中的運(yùn)動(dòng)干擾，需對(duì)其進(jìn)行麻醉。選擇合適的麻醉藥物和劑量，確保動(dòng)物在成像過程中處于穩(wěn)定狀態(tài)，保證獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，又能最大限度地保障動(dòng)物福利，確保其安全。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般較難合作，因此實(shí)驗(yàn)中常采用全身麻醉，根據(jù)麻醉方式分為吸入麻醉和非吸入麻醉。
生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)可以在底物注射后再進(jìn)行麻醉。
吸入麻醉與注射麻醉的區(qū)別如下表：
在生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)中，合適的儀器對(duì)確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。
理想的成像儀器應(yīng)具備以下特點(diǎn)：
1. 高靈敏度
選擇具有高靈敏度的儀器，以便檢測(cè)低水平的信號(hào)，這對(duì)于早期疾病檢測(cè)和微小變化的監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。
2. 高分辨率
考慮儀器的動(dòng)態(tài)范圍和分辨率，高分辨率儀器能夠提供更清晰的圖像，有助于更精確地定位和量化生物學(xué)過程。
3. 寬動(dòng)態(tài)范圍
儀器應(yīng)具有寬廣的動(dòng)態(tài)范圍，能夠同時(shí)檢測(cè)到從低到高的信號(hào)強(qiáng)度。以保證在不同條件下都能獲得清晰的信號(hào)和高質(zhì)量的圖像。儀器的背景噪聲應(yīng)盡可能低，以提高信噪比。
4. 操作便利性、環(huán)境適應(yīng)性及樣本兼容性
選擇用戶界面友好、易于操作的設(shè)備，且能夠適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)條件和樣本類型�？紤]儀器與其他實(shí)驗(yàn)設(shè)備的兼容性，以及未來升級(jí)或添加新功能的潛力。
5. 良好的技術(shù)支持和服務(wù)
確保在遇到操作或技術(shù)問題時(shí)能夠得到及時(shí)有效的幫助。綜合這些因素，選擇適合的生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)儀器，將有助于提高實(shí)驗(yàn)的成功率和數(shù)據(jù)的質(zhì)量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀和分析
獲取高質(zhì)量的成像數(shù)據(jù)只是研究的一部分，結(jié)果的判讀與數(shù)據(jù)分析同樣重要。它能幫助研究人員從圖像中提取有價(jià)值的信息，并得出科學(xué)結(jié)論。
1. 圖像優(yōu)化處理：采用軟件對(duì)拍攝到的圖像進(jìn)行優(yōu)化處理、灰度調(diào)節(jié)、偽彩色處理等，以提高圖像質(zhì)量。
2. 定義感興趣區(qū)域（ROI）：計(jì)算發(fā)光強(qiáng)度、發(fā)光面積、發(fā)光信號(hào)變化等參數(shù)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果�？墒褂媒y(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以得出有意義的結(jié)論。
3. 多圖分析：不同時(shí)間點(diǎn)成像結(jié)果的分析要用到多圖分析，數(shù)據(jù)歸一化有助于消除偏差，批量ROI圈選及計(jì)算，生成動(dòng)力學(xué)曲線、批量導(dǎo)出圖片及動(dòng)態(tài)展示等提高了結(jié)果的可讀性和理解性。
結(jié)論
- 利用溶酶體靶向的 NIR-II 熒光探針指導(dǎo) pH 激活的鼻咽癌光療
- AniView全光譜動(dòng)物活體成像系統(tǒng)助力OTBP-G新型聚集體熒光探針的研發(fā)
- 利用NIR-II激發(fā)抗淬滅苯硼酸改性共軛聚電解質(zhì)增強(qiáng)化學(xué)光熱療效
- 文獻(xiàn)解讀：超氧化物歧化酶3抑制細(xì)胞對(duì)寄生蟲感染的早期免疫反應(yīng)
- 利用NIR-II熒光有機(jī)納米探針成像監(jiān)測(cè)腫瘤激活光動(dòng)力療法的比例
- 動(dòng)物活體成像之熒光成像的基本原理、應(yīng)用領(lǐng)域及常見實(shí)驗(yàn)技巧
- 動(dòng)物活體成像之生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)技巧及注意事項(xiàng)
- AniView多模式動(dòng)物活體成像系統(tǒng)助力創(chuàng)傷性腦損傷診斷和手術(shù)監(jiān)測(cè)研究
- 瑞沃德將攜重磅新品亮相美國(guó)神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)年會(huì)SfN
- 瑞孚迪受邀出席第五屆跨國(guó)公司領(lǐng)導(dǎo)人青島峰會(huì)
- 博鷺騰AniView Kirin臺(tái)灣首秀,終端客戶驗(yàn)收交付成功
- 講座：詳解Hermes高內(nèi)涵斑馬魚成像分析系統(tǒng)
- 博鷺騰將亮相2024神經(jīng)科學(xué)發(fā)展論壇，誠(chéng)邀您撥冗蒞臨
- 勤翔推出IVScope 8000X多模式小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)
- 博鷺騰攜五大系列新品亮相Analytica 2024
- 博鷺騰第二屆華南動(dòng)物活體成像研討會(huì)圓滿舉辦
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