平端連接法克隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)步驟介紹
平頭連接是將制備好的平頭載體和補(bǔ)平或削平的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產(chǎn)物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。
如果要求不高，PCR產(chǎn)物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，這兩種酶有5’→3’校對能力，擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物已經(jīng)是平頭，可以不作平端處理。平端連接的一個(gè)顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應(yīng)體系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。
通常情況下，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進(jìn)行連接，但其連接效率效低。因?yàn)門aq DNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能在兩6條 DNA鏈的3'末端加上一個(gè)多余的堿基，使合成的PCR產(chǎn)物成為3'突出一個(gè)堿基的DNA分子。
這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產(chǎn)物的效率通過較高，在采用大量T4 DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時(shí)，可顯著提高其連接效率。
對于較短PCR產(chǎn)物，用PUS19的HincⅡ位點(diǎn)進(jìn)行克隆，以X-gal和IPTG篩選，�？傻玫阶懔恐亟M子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產(chǎn)物。
實(shí)驗(yàn)步驟：
一、PCR反應(yīng)
1. 依次混勻下列試劑
（1）H2O：35 μl
（2）10×PCR反應(yīng)緩沖液：5 μl
（3）25 mmol/L MgCl2：4 μl
（4） 4種dNTP：4 μl
（5）上游引物（引物1）：0.5 μl
（6）下游引物（引物2）：0.5 μl
（7）模板DNA（約1 ng）：0.5 μl
（8）混勻后離心5秒。
2. 將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷，迅速離心數(shù)秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5 μl約2.5 U），混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。
3. 用94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘， 72℃延伸2分鐘， 循環(huán)35輪，進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后， 于72℃下保溫10分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。
二、電泳
取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長度。
三、PCR產(chǎn)物的純化
擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物如利用T-Vector進(jìn)行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產(chǎn)物純化。
1. 酚/ lv仿法
（1）取反應(yīng)產(chǎn)物加100 μl TE。
（2）加等體積lv仿混勻后用微型離心機(jī)10000 rpm離心15秒，用移液器將上層水相吸至新的小管中。這樣抽提一次， 可除去覆蓋在表面的礦物油。
（3）再用酚:lv仿:抽提二次，每次回收上層水相。
（4）在水相中加300 μl 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。
（5）在小離心機(jī)上10000 rpm離心10 min，吸凈上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍離后，吸凈上清液.重復(fù)洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7 ml ddH2O 中，待用。
2. Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)
Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)可以快速、有效、可靠地提取PCR擴(kuò)增液中的DNA，提純后的DNA可用于測序、標(biāo)記、克隆等。 該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可供50次PCR產(chǎn)物的純化，試劑包括：50 ml Wizard PCR DNA純化樹脂、5 ml 直接提取緩沖液、50支 Wizard微型柱。
（1）吸取PCR反應(yīng)液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
（2）加100 ml直接提取緩沖液，渦旋混勻。
（3）加1 ml PCR DNA純化樹脂，1分鐘內(nèi)渦旋混合3次。
（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒與Wizard微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進(jìn)入微型柱。
（5）將注射器與微型柱分開，取出注塞， 再將注射筒與微型柱相連，加入2 ml 80%異丙醇，對微型柱進(jìn)行清洗。
（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g離心20秒，以除去微型柱中的洗液。
（7）將微型柱放在一個(gè)新eppendorf管中，加50 μl TE或水，靜止1分鐘后，12 000 g離心20秒。
（8）丟棄微型柱，eppendorf管中的溶液即為純化DNA，存放于4℃或-20℃。
四、載體加dT尾
1. 將1 μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
2. 在小管中按上述PCR反應(yīng)，加入各種混合物，除將4 μl 4種dNTP改為4 μl 25 mM dTTP。
3. 加入1 μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加熱2 h。
4. 按前面三中所述，用酚:lv仿:抽提二次。
5. 加入2倍體積 95％乙醇，在-20℃下沉淀1 h。
6、離心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。
五、PCR產(chǎn)物與載體粘末端連接
1. 在7 ml PCR產(chǎn)物中加1 ml帶dT尾的pUC質(zhì)粒。
2. 加1 ml T4DNA連接酶，1 ml 10×連接緩中液，混勻，16℃連接過夜。
3. 取5 ml連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并篩選重組子。
六、PCR產(chǎn)物3'突出端切平及平末端連接
1. 在50 ml的PCR產(chǎn)物中，直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混勻。
2. 37℃反應(yīng)10分鐘后，70℃滅活10分鐘。
3. 用酚:lv仿抽提2次。
4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7 ml ddH2O中。
5. 質(zhì)粒用Smal 切開后，70℃ 15分鐘滅活酶，取1 ml （約0.1 mg）加入上述PCR產(chǎn)物中。加T4 DNA連接酶1 ml ，連接緩沖液1 ml 。
6. 取5 ml 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并篩選重組子。
注意事項(xiàng)：
1. PCR反應(yīng)液可直接用于連接，但最好對PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接，既能去掉dNTP與ATP競爭連接酶又能濃縮PCR產(chǎn)物。
2. PCR非常靈敏， 操作應(yīng)盡可能在無菌操作臺中進(jìn)行。
3. 吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌， 每次吸頭用畢應(yīng)更換， 不要互相污染試劑。
4. 加試劑前， 應(yīng)短促離心10秒鐘， 然后再打開管蓋， 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面。
5. 應(yīng)設(shè)含除模板DNA所有其它成分的負(fù)對照。
6. 純化樹脂在使用前必須充分混勻。
7. PCR產(chǎn)物中礦物油應(yīng)盡量吸去，否則會影響提取DNA的 產(chǎn)量。
如果要求不高，PCR產(chǎn)物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，這兩種酶有5’→3’校對能力，擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物已經(jīng)是平頭，可以不作平端處理。平端連接的一個(gè)顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應(yīng)體系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。
通常情況下，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進(jìn)行連接，但其連接效率效低。因?yàn)門aq DNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能在兩6條 DNA鏈的3'末端加上一個(gè)多余的堿基，使合成的PCR產(chǎn)物成為3'突出一個(gè)堿基的DNA分子。
這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產(chǎn)物的效率通過較高，在采用大量T4 DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時(shí)，可顯著提高其連接效率。
對于較短PCR產(chǎn)物，用PUS19的HincⅡ位點(diǎn)進(jìn)行克隆，以X-gal和IPTG篩選，�？傻玫阶懔恐亟M子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產(chǎn)物。
實(shí)驗(yàn)步驟：
一、PCR反應(yīng)
1. 依次混勻下列試劑
（1）H2O：35 μl
（2）10×PCR反應(yīng)緩沖液：5 μl
（3）25 mmol/L MgCl2：4 μl
（4） 4種dNTP：4 μl
（5）上游引物（引物1）：0.5 μl
（6）下游引物（引物2）：0.5 μl
（7）模板DNA（約1 ng）：0.5 μl
（8）混勻后離心5秒。
2. 將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷，迅速離心數(shù)秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5 μl約2.5 U），混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。
3. 用94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘， 72℃延伸2分鐘， 循環(huán)35輪，進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后， 于72℃下保溫10分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。
二、電泳
取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長度。
三、PCR產(chǎn)物的純化
擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物如利用T-Vector進(jìn)行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產(chǎn)物純化。
1. 酚/ lv仿法
（1）取反應(yīng)產(chǎn)物加100 μl TE。
（2）加等體積lv仿混勻后用微型離心機(jī)10000 rpm離心15秒，用移液器將上層水相吸至新的小管中。這樣抽提一次， 可除去覆蓋在表面的礦物油。
（3）再用酚:lv仿:抽提二次，每次回收上層水相。
（4）在水相中加300 μl 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。
（5）在小離心機(jī)上10000 rpm離心10 min，吸凈上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍離后，吸凈上清液.重復(fù)洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7 ml ddH2O 中，待用。
2. Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)
Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)可以快速、有效、可靠地提取PCR擴(kuò)增液中的DNA，提純后的DNA可用于測序、標(biāo)記、克隆等。 該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可供50次PCR產(chǎn)物的純化，試劑包括：50 ml Wizard PCR DNA純化樹脂、5 ml 直接提取緩沖液、50支 Wizard微型柱。
（1）吸取PCR反應(yīng)液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
（2）加100 ml直接提取緩沖液，渦旋混勻。
（3）加1 ml PCR DNA純化樹脂，1分鐘內(nèi)渦旋混合3次。
（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒與Wizard微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進(jìn)入微型柱。
（5）將注射器與微型柱分開，取出注塞， 再將注射筒與微型柱相連，加入2 ml 80%異丙醇，對微型柱進(jìn)行清洗。
（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g離心20秒，以除去微型柱中的洗液。
（7）將微型柱放在一個(gè)新eppendorf管中，加50 μl TE或水，靜止1分鐘后，12 000 g離心20秒。
（8）丟棄微型柱，eppendorf管中的溶液即為純化DNA，存放于4℃或-20℃。
四、載體加dT尾
1. 將1 μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
2. 在小管中按上述PCR反應(yīng)，加入各種混合物，除將4 μl 4種dNTP改為4 μl 25 mM dTTP。
3. 加入1 μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加熱2 h。
4. 按前面三中所述，用酚:lv仿:抽提二次。
5. 加入2倍體積 95％乙醇，在-20℃下沉淀1 h。
6、離心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。
五、PCR產(chǎn)物與載體粘末端連接
1. 在7 ml PCR產(chǎn)物中加1 ml帶dT尾的pUC質(zhì)粒。
2. 加1 ml T4DNA連接酶，1 ml 10×連接緩中液，混勻，16℃連接過夜。
3. 取5 ml連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并篩選重組子。
六、PCR產(chǎn)物3'突出端切平及平末端連接
1. 在50 ml的PCR產(chǎn)物中，直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混勻。
2. 37℃反應(yīng)10分鐘后，70℃滅活10分鐘。
3. 用酚:lv仿抽提2次。
4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7 ml ddH2O中。
5. 質(zhì)粒用Smal 切開后，70℃ 15分鐘滅活酶，取1 ml （約0.1 mg）加入上述PCR產(chǎn)物中。加T4 DNA連接酶1 ml ，連接緩沖液1 ml 。
6. 取5 ml 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并篩選重組子。
注意事項(xiàng)：
1. PCR反應(yīng)液可直接用于連接，但最好對PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接，既能去掉dNTP與ATP競爭連接酶又能濃縮PCR產(chǎn)物。
2. PCR非常靈敏， 操作應(yīng)盡可能在無菌操作臺中進(jìn)行。
3. 吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌， 每次吸頭用畢應(yīng)更換， 不要互相污染試劑。
4. 加試劑前， 應(yīng)短促離心10秒鐘， 然后再打開管蓋， 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面。
5. 應(yīng)設(shè)含除模板DNA所有其它成分的負(fù)對照。
6. 純化樹脂在使用前必須充分混勻。
7. PCR產(chǎn)物中礦物油應(yīng)盡量吸去，否則會影響提取DNA的 產(chǎn)量。
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