單細(xì)胞腦類(lèi)器官篩選用于鑒定自閉癥的發(fā)育缺陷

文章詳情

文章標(biāo)題：Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism
中文標(biāo)題：?jiǎn)渭?xì)胞腦類(lèi)器官篩選用于鑒定自閉癥的發(fā)育缺陷
期刊：Nature
IF：50.5
研究機(jī)構(gòu)：奧地利科學(xué)院分子生物技術(shù)研究所（IMBA）
doi: 10.1038/s41586-023-06473-y

01 簡(jiǎn)介

人類(lèi)大腦的發(fā)育涉及許多獨(dú)特且復(fù)雜的過(guò)程，這些過(guò)程在其他許多物種中都未曾見(jiàn)到。這些過(guò)程可能導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙（Neurodevelopmental disorder, NDD），如自閉癥譜系障礙（ASD）。ASD的檢測(cè)只能在發(fā)育成熟的大腦中實(shí)現(xiàn)。腦類(lèi)器官作為一種類(lèi)大腦的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，提供了在體外研究人類(lèi)大腦發(fā)育的可能性。雖然腦類(lèi)器官可以用來(lái)在人體環(huán)境中研究神經(jīng)發(fā)育障礙，但也受到變異性和低通量的限制。本文介紹了一種結(jié)合了類(lèi)器官、基因編輯及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的新系統(tǒng)，用于研究ASD相關(guān)基因?qū)��?xì)胞命運(yùn)決定和發(fā)育階段的影響。

研究者開(kāi)發(fā)了CRISPR-human organoids-scRNA-seq（CHOOSE）系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)結(jié)合了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，用于高效篩選和分析與ASD相關(guān)的基因。使用已驗(yàn)證的gRNA對(duì)和可誘導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在類(lèi)器官中進(jìn)行基因敲除篩選，可以使類(lèi)器官中的每個(gè)細(xì)胞最多攜帶一個(gè)特定ASD基因的突變。利用單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)，包括轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性構(gòu)建類(lèi)器官的發(fā)育基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在單細(xì)胞水平上追蹤每個(gè)突變的影響。隨后，研究了36個(gè)與ASD相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)基因?qū)��?xì)胞類(lèi)型和發(fā)育軌跡的影響。

02 技術(shù)路線

1、類(lèi)器官生成
使用人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（hESCs）生成類(lèi)器官，確保類(lèi)器官中存在豐富的端腦組織。

2、gRNA設(shè)計(jì)和驗(yàn)證
針對(duì)每個(gè)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)一對(duì)引導(dǎo)RNA（gRNA），選擇與自閉癥譜系障礙（ASD）相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)基因。這些基因與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育過(guò)程相關(guān)，具有研究?jī)r(jià)值。

3、構(gòu)建CRISPR載體
使用誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將gRNA和Cas9基因構(gòu)建到同一個(gè)載體中。這種系統(tǒng)可以通過(guò)加入誘導(dǎo)劑（如四環(huán)素）激活Cas9的表達(dá)，從而控制基因敲除的時(shí)間和空間。將CRISPR載體轉(zhuǎn)染入hESCs，通過(guò)抗性篩選和流式細(xì)胞術(shù)確定成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。

4、克隆條形碼標(biāo)記
為每個(gè)dual-sgRNA cassette引入克隆條形碼，以標(biāo)記各個(gè)細(xì)胞的遺傳操作。這些條形碼在單細(xì)胞測(cè)序中用于追蹤每個(gè)細(xì)胞的遺傳背景。通過(guò)PCR和測(cè)序驗(yàn)證條形碼的獨(dú)特性，確保每個(gè)細(xì)胞克隆都可以被準(zhǔn)確識(shí)別來(lái)驗(yàn)證條形碼的獨(dú)特性和穩(wěn)定性。

5、單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）
將類(lèi)器官解離成單細(xì)胞懸液，使用10x Genomics Chromium系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞捕獲和cDNA合成。構(gòu)建單細(xì)胞RNA測(cè)序文庫(kù)，使用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，獲取每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

6、數(shù)據(jù)分析
對(duì)單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，包括過(guò)濾低質(zhì)量細(xì)胞和去除背景噪音。使用聚類(lèi)分析和標(biāo)記基因表達(dá)水平，鑒定類(lèi)器官中的不同細(xì)胞類(lèi)型。應(yīng)用偽時(shí)間分析（pseudotime analysis）構(gòu)建細(xì)胞發(fā)育軌跡，研究不同基因敲除對(duì)細(xì)胞分化路徑的影響。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)組數(shù)據(jù)，構(gòu)建類(lèi)器官的發(fā)育基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，識(shí)別ASD相關(guān)基因的調(diào)控模塊。

7、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
在特異性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）生成的患病類(lèi)器官中，驗(yàn)證關(guān)鍵基因（如ARID1B）對(duì)細(xì)胞命運(yùn)決定的影響，與未進(jìn)行基因編輯的類(lèi)器官進(jìn)行對(duì)照，分析基因敲除的具體效應(yīng)。

03 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Figure 1

展示了用于人腦類(lèi)器官中ASD風(fēng)險(xiǎn)基因篩選的CHOOSE系統(tǒng)。使用了帶有條形碼的雙sgRNA，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)估了gRNA的編輯效率和分布。通過(guò)UMAP展示了scRNA-seq數(shù)據(jù)集中的背側(cè)和腹側(cè)大腦區(qū)域軌跡。熱圖展示了不同細(xì)胞類(lèi)型中標(biāo)志基因的表達(dá)，RNA速率分析顯示了發(fā)育方向 。
 

Figure 2

顯示了24個(gè)基因干擾下細(xì)胞類(lèi)型豐度的顯著變化。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因干擾導(dǎo)致背側(cè)-腹側(cè)細(xì)胞比例的降低。具體基因如KMT2C的干擾導(dǎo)致背側(cè)細(xì)胞的減少和腹側(cè)細(xì)胞的增加。某些基因干擾只影響特定細(xì)胞類(lèi)型，例如ADNP、MED13L、ILF2和DDX3X 。

Figure 3

比較了不同基因干擾條件下的基因表達(dá)變化。圖中展示了DEGs（差異表達(dá)基因）在不同TF模塊中的富集情況，如MEF2C、BCL11A、SATB2和OLIG1。這些富集的TF模塊與ASD的相關(guān)基因有顯著的關(guān)聯(lián) 。

Figure 4

描述了一位ARID1B突變患者的腦發(fā)育情況。使用SNP分型顯示在6號(hào)染色體上的一個(gè)微缺失。患者在兩個(gè)妊娠階段的GE（LGE和CGE）體積與年齡匹配的對(duì)照組的比較。數(shù)據(jù)表明，ARID1B突變可能導(dǎo)致GE體積的異常增大 。這些圖展示了ASD相關(guān)基因在腦類(lèi)器官中的影響，揭示了基因干擾如何導(dǎo)致特定細(xì)胞類(lèi)型的變化以及這些變化與ASD癥狀的潛在關(guān)聯(lián)。

04 總結(jié)

這項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)了一種高效的CHOOSE系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了在類(lèi)器官中進(jìn)行大規(guī)模基因功能研究的可能性。研究結(jié)果表明，ASD高風(fēng)險(xiǎn)基因?qū)Υ竽X類(lèi)器官的發(fā)育有顯著影響，特別是在細(xì)胞命運(yùn)決定和發(fā)育階段的調(diào)控上。干擾BAF復(fù)合物的成員（如ARID1B）會(huì)導(dǎo)致腹側(cè)端腦祖細(xì)胞數(shù)量增加，且ARID1B控制祖細(xì)胞向少突膠質(zhì)前體細(xì)胞和中間神經(jīng)元的轉(zhuǎn)變。這一發(fā)現(xiàn)通過(guò)患者特異性iPSC衍生的類(lèi)器官得到了驗(yàn)證。這項(xiàng)研究為在人類(lèi)類(lèi)器官模型中表征疾病易感基因的表型奠定了基礎(chǔ)。

本文創(chuàng)新性地結(jié)合了CRISPR基因編輯和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，建立了一個(gè)強(qiáng)大的篩選系統(tǒng)，揭示了ASD相關(guān)基因在大腦發(fā)育中的重要作用。研究結(jié)果不僅拓展了我們對(duì)自閉癥發(fā)病機(jī)制的理解，還為未來(lái)利用類(lèi)器官模型進(jìn)行疾病研究和藥物篩選提供了新方法。