酵母單雜建庫(kù)與篩庫(kù)技術(shù)解析

瀏覽次數(shù)：173　發(fā)布日期：2024-9-10　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用在基因表達(dá)調(diào)控中扮演著至關(guān)重要的角色。酵母單雜交技術(shù)通過(guò)在酵母細(xì)胞中檢測(cè)特定蛋白質(zhì)與目標(biāo)DNA序列的結(jié)合事件，提供了研究這些相互作用的有效方法。借助于酵母雜交系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)，酵母單雜交能夠高效地鑒定調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。

酵母單雜交技術(shù)是一種基于報(bào)告基因的檢測(cè)方法，通過(guò)在酵母細(xì)胞中構(gòu)建含有特定DNA序列的誘餌載體，研究與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。

1. 誘餌DNA序列：在酵母表達(dá)載體中插入目標(biāo)DNA序列，并與報(bào)告基因（如HIS3或lacZ）相連。當(dāng)特定蛋白質(zhì)與該誘餌DNA結(jié)合時(shí)，報(bào)告基因的表達(dá)會(huì)被激活，從而使酵母細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
2. 融合蛋白與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域：候選轉(zhuǎn)錄因子與一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（如GAL4 AD）融合，表達(dá)于酵母細(xì)胞中。當(dāng)這些融合蛋白與誘餌DNA結(jié)合時(shí)，激活結(jié)構(gòu)域?qū)?dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。
通過(guò)酵母雜交系統(tǒng)，酵母單雜交技術(shù)能夠在體內(nèi)模擬蛋白-DNA相互作用，為研究轉(zhuǎn)錄因子提供了有力支持。

酵母單雜建庫(kù)的構(gòu)建步驟

酵母單雜建庫(kù)是酵母單雜交技術(shù)的基礎(chǔ)。一個(gè)多樣化的酵母單雜建庫(kù)能夠囊括各種不同組織或細(xì)胞的cDNA庫(kù)，從而提高識(shí)別目標(biāo)DNA結(jié)合蛋白的機(jī)會(huì)。

酵母單雜建庫(kù)的構(gòu)建流程

1. mRNA提取與cDNA合成：從特定生物體的組織或細(xì)胞中提取mRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。這些cDNA代表了所有可能的轉(zhuǎn)錄因子。
2. cDNA克隆入載體：將合成的cDNA克隆到酵母表達(dá)載體中，載體中通常含有GAL4激活結(jié)構(gòu)域以促進(jìn)在誘餌結(jié)合時(shí)的報(bào)告基因表達(dá)。
3. 酵母轉(zhuǎn)化：將攜帶cDNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞中，形成一個(gè)完整的酵母單雜建庫(kù)。確保庫(kù)的規(guī)模足夠大，以覆蓋所有潛在的蛋白質(zhì)-DNA相互作用。

酵母單雜篩庫(kù)的操作

篩庫(kù)流程
酵母單雜篩庫(kù)用于在一個(gè)酵母單雜建庫(kù)中識(shí)別出與特定DNA序列相互作用的轉(zhuǎn)錄因子。篩庫(kù)步驟包括：

1. 共轉(zhuǎn)化：將含有目標(biāo)DNA誘餌的報(bào)告基因載體與酵母單雜建庫(kù)中的cDNA載體共同轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞中。每個(gè)細(xì)胞都將表達(dá)一個(gè)不同的融合蛋白。
2. 選擇性培養(yǎng)：在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，只有那些能夠與DNA誘餌結(jié)合并激活報(bào)告基因的融合蛋白才能使酵母細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
3. 鑒定陽(yáng)性克隆：使用PCR、測(cè)序等方法鑒定陽(yáng)性克隆，確定與目標(biāo)DNA序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。

篩選結(jié)果的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，研究人員通常采用以下方法：

- 重新轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：將篩選出的陽(yáng)性克隆重新轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞中，以確認(rèn)這些克隆與目標(biāo)DNA序列的特異性結(jié)合。
- 體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：采用電泳遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（EMSA）或染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)在體外驗(yàn)證蛋白-DNA相互作用的特異性和穩(wěn)定性。
- 功能分析：通過(guò)基因過(guò)表達(dá)或敲除實(shí)驗(yàn)研究轉(zhuǎn)錄因子的功能，以了解其在基因調(diào)控中的作用。

酵母單雜交技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域

酵母單雜交技術(shù)由于其高效性和可靠性，在多種研究領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值：

- 基因調(diào)控機(jī)制研究：通過(guò)鑒定與特定啟動(dòng)子序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，酵母單雜交技術(shù)幫助構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析基因表達(dá)的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制。
- 轉(zhuǎn)錄因子的篩選與功能研究：利用酵母單雜交技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄因子，并進(jìn)一步研究這些因子在生物過(guò)程中的功能。
- 疾病相關(guān)研究：在研究疾病，如癌癥和代謝病時(shí)，酵母單雜交技術(shù)能夠鑒定關(guān)鍵調(diào)控序列和相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，為新型治療策略提供靶點(diǎn)。

酵母單雜交技術(shù)通過(guò)構(gòu)建酵母單雜建庫(kù)和執(zhí)行酵母單雜篩庫(kù)，提供了一種有效研究蛋白-DNA相互作用的手段。酵母雜交系統(tǒng)在這一過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，使得研究人員能夠在體內(nèi)環(huán)境中高效地篩選和鑒定目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，酵母單雜交技術(shù)將在基因調(diào)控研究和轉(zhuǎn)錄因子功能研究中發(fā)揮更為廣泛的應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)
1. Wang, H., Wang, Z., & Wang, Y. (2011). The yeast one-hybrid system: An effective method for screening gene transcription factors. Nature Protocols, 6(6), 768-775.
2. Reece-Hoyes, J. S., & Marian Walhout, A. J. (2012). Yeast one-hybrid assays: A tool to dissect protein-DNA interactions. Methods in Molecular Biology, 812, 189-208.
3. Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., & Walhout, A. J. M. (2004). A Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid System. Genome Research, 14(10b), 2093-2101.
4. Li, H., & Herskowitz, I. (1993). Isolation of the ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science, 262(5135), 1870-1874.
5. Bruckner, A., & Lehming, N. (2003). Yeast One- and Two-Hybrid Systems for the Analysis of Protein-Protein and Protein-DNA Interactions. Current Genetics, 42(3), 225-235.

索取資料

來(lái)源：泰克生物科技（天津）有限公司
聯(lián)系電話：400-168-8285
E-mail：info@tekbiotech.com

【點(diǎn)擊可查看泰克生物科技（天津）有限公司相關(guān)服務(wù)】

標(biāo)簽：酵母單雜篩庫(kù) 酵母單雜建庫(kù) 酵母雜交系統(tǒng)

分享到：QQ空間新浪微博騰訊微博微信

【所有文章】【本類新聞】【相關(guān)服務(wù)】【關(guān)閉窗口】

本類文章

本類新聞