入射光熒光顯微鏡的發(fā)展歷史
熒光顯微鏡先驅(qū) Johan Sebastiaan Ploem
自上世紀中葉以來，熒光顯微鏡發(fā)展成為一種生物科學(xué)工具，對我們了解生命產(chǎn)生了最大的影響。在熒光分子的幫助下觀察細胞和蛋白質(zhì)是當今幾乎所有生命科學(xué)學(xué)科的標準方法。這種廣泛的應(yīng)用可以追溯到一些研究人員的技術(shù)工作，他們希望改進和簡化熒光顯微鏡下的勞動。荷蘭醫(yī)生約翰-塞巴斯蒂安-普洛姆（Johann Sebastiaan Ploem）就是其中的一位參與者。
外熒光顯微鏡
約翰-塞巴斯蒂安-普洛姆（Johann Sebastiaan Ploem）于 1927 年出生在蘇門答臘島的澤蘭托（Sawahlunto），是一名荷蘭煤礦工程師的兒子。幼年時，他隨父母回到荷蘭，并在那里將繪畫作為自己的愛好之一。高中畢業(yè)后，他發(fā)現(xiàn)了另一個令人著迷的色彩領(lǐng)域，我們稍后會了解到。Ploem 決定學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)，并在烏得勒支、哈佛和阿姆斯特丹接受教育。隨后，他開始了學(xué)術(shù)生涯，曾在邁阿密大學(xué)和阿姆斯特丹大學(xué)工作，后晉升為荷蘭萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)系教授。
在研究活動中，他發(fā)現(xiàn)熒光顯微鏡是一種強大的工具。20 世紀 60 年代，一種特殊的標本照明方式開始流行，事實上，早在 1925 年，對絲蟲自發(fā)熒光事件感興趣的 Policard 和 Paillot 就已經(jīng)知道并描述了這種照明方式（Policard 和 Paillot，1925 年）。一些研究人員重新啟動了這兩位法國科學(xué)家的項目，將熒光照明和樣品檢測放在顯微鏡的同一側(cè)。這種利用入射光的原理被稱為 "Epi-Illumination"，與透射顯微鏡形成鮮明對比。在熒光顯微鏡中使用這種技術(shù)的一大好處是可以避免檢測光源發(fā)出的發(fā)射光（圖 1）。另一個優(yōu)點是機械性更強：在透射照明中，聚光器和物鏡有兩個獨立的光軸，必須仔細對準。而在外延照明中，物鏡既是聚光器，又是集光物鏡。這樣就可以避免對準問題。
圖 1：外延照明在熒光顯微鏡中的優(yōu)勢：在透射照明的情況下（左圖），光源和圖像檢測位于物鏡的兩側(cè)。在這種設(shè)置下，一個明顯的限制就是無法檢測到激發(fā)光（淺藍色）。相比之下，Epi-Illumination（右圖）使用物鏡進行照明和圖像檢測。對于熒光顯微鏡來說，這意味著用戶不會受到激發(fā)光的照射。
二向色分光鏡
早在幾年前，前蘇聯(lián)的兩位研究人員就為熒光外延照明顯微鏡提供了非常重要的投入。Brumberg 和 Krylova 開發(fā)了一種所謂的二向色分光器，用于入射光的紫外激發(fā)（Brumberg 和 Krylova，1952 年）。
二向色材料能夠讓特定波長范圍的光通過，而其他波長的光則被反射（圖 2）。
這一原理對于熒光外延照明是不可或缺的，因為激發(fā)光必須以某種方式融合到顯微鏡的光路中（圖 3）。更確切地說，二向色分光鏡無法穿透光源發(fā)出的所需激發(fā)光的波長，只能將激發(fā)光反射到樣品上。樣品發(fā)出的熒光反過來又可以通過二向色分光器到達檢測端。
圖 3：熒光外延照明需要一個二向色鏡（灰色），它能夠?qū)⒓ぐl(fā)光（藍色）反射到試樣上，并將發(fā)射光（綠色）傳遞到檢測端。激發(fā)光的波長可通過相應(yīng)的濾光片（橙色）進行預(yù)選。朝向檢測側(cè)的濾光片（紫色）只允許熒光團的波長通過，并排除激發(fā)光的殘余雜散光。
遺憾的是，由于鐵幕之間缺乏信息交流，Ploem 并不知道俄羅斯的發(fā)展情況。盡管如此，他還是自己開始使用二向色分光鏡。針對 Ploem 的特殊情況，他與著名的特種玻璃生產(chǎn)商肖特公司（美因茨）共同開發(fā)了一種可反射藍光和綠光的分光鏡（Ploem，1965 年）。之后，他用 Leitz 公司提供的中性分光鏡改裝了一臺 "Opak" 外延照明器，通過引入一個帶有四個不同二向色分光鏡的滑塊，他可以在紫外線、紫光、藍光和綠光之間非�？焖佟⒎奖愕馗淖兗ぐl(fā)光的波長（Ploem，1967 年）（圖 4）。
圖 4：熒光多波長外延照明器，帶有四個安裝在滑塊中的二向色分光鏡，用于紫外、紫光、藍光和綠光的入射照明。由阿姆斯特丹大學(xué)制造（Ploem，1965 年）。
熒光濾光器立方體
開發(fā)二向色分光鏡以產(chǎn)生不同波長的激發(fā)光具有重要的優(yōu)勢。當時，紫外光譜（約 100 nm - 380 nm）的激發(fā)光非常普遍，但卻有一個惱人的副作用：自發(fā)熒光。很多組織物質(zhì)都會被紫外線激發(fā)，從而產(chǎn)生微弱的背景光（圖 5）。通過將二向色鏡的反射波長調(diào)整到綠色或藍色范圍，Ploem 能夠達到當時非常常用的兩種熒光染料 FITC（494 納米）和 TRITC（541 納米）的激發(fā)最大值，而不會產(chǎn)生自發(fā)熒光。FITC（異硫氰酸熒光素）和 TRITC（四甲基羅丹明-5（和 6）-異硫氰酸酯）可與抗體耦合，目前仍用于免疫熒光顯微鏡。通過在較小范圍內(nèi)達到其激發(fā)最大值，組織標本的對比度得到了顯著增強（圖 5）。使用 Ploem 的二向色分光器產(chǎn)生的激發(fā)光束能有效地與 FITC 的激發(fā)最大值相匹配，即使是發(fā)射光譜很差的光源也能使用。
圖 5：左圖：用寬波段紫外激發(fā)光照射標記有免疫標記（FITC）的組織細胞。注意帶有藍色自發(fā)熒光的組織結(jié)構(gòu)。右圖 使用窄波段藍光（490 納米）外延照明，對相同的組織和相同的 FITC 標記進行免疫染色。注意圖像對比度的增加（Ploem，1967 年）。
有鑒于此，現(xiàn)在可以利用外延照明的優(yōu)勢，使用普通的高壓汞弧光燈提供藍光和綠光的窄帶激發(fā)。這一改進滿足了生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)晒怙@微鏡的需求。
根據(jù) Ploem 的發(fā)明，Leitz 設(shè)計出了一種新型多波長熒光外延照明器，它帶有四個旋轉(zhuǎn)式二向色分光鏡，可在紫外、紫光、藍光和綠光范圍內(nèi)激發(fā)標本，這就是 Leitz PLOEMOPAK。
萊茨員工卡夫（W. Kraft）取得了更大的成就，他將二向色分光器與適當?shù)募ぐl(fā)和發(fā)射濾光器組合在一個工件上，即所謂的濾光器立方體或濾光器塊（卡夫，1969 年和卡夫，1972 年）（圖 6）。他的研究成果是設(shè)計出了一種外延照明器，該照明器帶有多組四個這樣的濾光器立方體，如今幾乎所有的多波長熒光顯微鏡都是以這些濾光器立方體為基礎(chǔ)的。
總 結(jié)
有了 Ploem 及其同代人和后繼者建立起來的技術(shù)基礎(chǔ)，我們今天就可以通過將適當?shù)臑V光器立方體放入外延照明器（圖 7），觀察到無數(shù)不同的熒光團。研究人員甚至可以根據(jù)自己的需要定制激發(fā)和發(fā)射參數(shù)。
由于現(xiàn)代研究顯微鏡的自動化，在實驗過程中切換濾光器立方體只需點擊一下按鈕�？茖W(xué)家們可以在一瞬間切換不同的熒光團，從而觀察到即使是活體標本也被熒光標記為不同的熒光團。
參考文獻：
1.Brumberg, E. M., Krylova, T. N.: O fluoreschentnykh mikroskopopak. Zh. obshch. biol. 14, 461, 1953.
2.Ploem, J. S.: Die Möglichkeit der Auflichtfluoreszenzmethoden bei Untersuchungen von Zellen in Durchströmungskammern und Leightonröhren. Xth Symposium d. Gesellschaft f. Histochemie, 1965. Acta Histochem. Suppl. 7, 339–343, 1967.
3.Ploem, J. S.: The use of a vertical illuminator with interchangeable dichroic mirrors for Fluorescence microscopy with incident light. Zeitschr. f. wiss. Mikroskopie 68, 129–142, 1967.
4.Kraft, W.: Die Technologie des Fluoreszenzopak, Leitz Mitt. Wiss. u. Techn. IV/6, 239–242, 1969.
5.Kraft, W.: Fluorescence Microscopy and Instrument Requirements. Leitz Mitt. Wiss. u. Techn. V/7, 193–206, 1972.
6.Policard, A., Paillot, A.: Etude de la sécrétion de la soie à I'aide des rayons ultraviolets filtrés (lumière de Wood). Comptes Rendus de l'Académie des Sciences Paris 181, 378–380, 1925.
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