光片顯微鏡技術(shù)：不同光片的特性與應(yīng)用

圖 1 顯示了比較中包含的六種光片類型的示意圖。利用照明物鏡后焦平面電場的幅度和相位來模擬樣品體積中光束的強(qiáng)度分布。展示了光束掃描或光片抖動產(chǎn)生的光片在照明和檢測軸（YZ）以及掃描軸和檢測軸（XZ）上的截面。

光片截面：

• YZ 軸：沿照明和檢測軸的截面

•  XZ 軸：沿掃描軸和檢測軸的截面

六種光片類型

1、高斯光束光片

簡介：激光理想情況下發(fā)射高斯光束，高斯光束的強(qiáng)度分布沿徑向方向遵循高斯分布，并在傳播方向上保持這種分布。

生成方法：通過圓柱透鏡生成，或通過在檢測物鏡的焦平面掃描高斯光束生成。

特點(diǎn)：這種光片類型最為常見，具有保守的強(qiáng)度分布。

2、聚焦平頂光束光

簡介：通過均勻照明物鏡的后焦平面生成，焦平面中的強(qiáng)度分布稱為“艾里盤”。

生成方法：擴(kuò)展高斯光束，使其直徑遠(yuǎn)大于物鏡后焦平面。

特點(diǎn)：更多的光以較大的角度進(jìn)入焦點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)更緊的聚焦，但代價(jià)是產(chǎn)生附加的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

3、貝塞爾光束晶格光片

簡介：等間距貝塞爾光束的相干疊加形成的光片。

生成方法：根據(jù)光束間隔的距離，產(chǎn)生不同的干涉圖樣，如方形晶格和六邊形晶格。

特點(diǎn)：通過調(diào)整參數(shù)b，可以在主瓣厚度和光學(xué)切片之間進(jìn)行權(quán)衡。

4、艾里光束光片

簡介：具有“香蕉狀”彎曲形狀的光束，通過對高斯光束施加三次相位生成。

生成方法：例如，使用空間光調(diào)制器。

特點(diǎn)：具有自重構(gòu)特性，可以在散射或吸收障礙物后恢復(fù)其初始強(qiáng)度分布。

5、球差光束光片

簡介：當(dāng)用于聚焦平行光的物鏡用于聚焦散焦或聚焦光時(shí)，焦點(diǎn)遠(yuǎn)離物鏡的本地焦平面，產(chǎn)生球差光束。

生成方法：通過徑向依賴的雙二次相位掩模模擬。

特點(diǎn)：唯一一個(gè)在沿照明軸的剖面不對稱的光束。

6、雙光束光片

簡介：由兩個(gè)光束（“子光束”）聚焦通過物鏡，然后相對于彼此和物鏡的光軸以一定角度傳播，并在物鏡的焦平面產(chǎn)生干涉圖案。

生成方法：通過分裂激光光束，將兩個(gè)子光束對稱地送入后焦平面。

特點(diǎn)：生成一個(gè)光片堆棧，中央和最強(qiáng)的光片放置在檢測透鏡的焦平面上，輔助光片照亮平行平面。

圖 1 通過展示不同類型光片在樣品體積中的強(qiáng)度分布，比較了這些光片在實(shí)際應(yīng)用中的效果和特點(diǎn)。通過對比，可以更直觀地了解每種光片類型在特定應(yīng)用中的優(yōu)缺點(diǎn)。
 

高斯光束

簡單高效的經(jīng)典選擇

高斯光束以其生成和控制的簡便性著稱。通過標(biāo)準(zhǔn)的圓柱透鏡或聚焦透鏡即可生成高斯光束，光束能量集中在中心，呈高斯分布。

高斯光束在軸向分辨率方面表現(xiàn)出色，能夠清晰分辨樣品中的細(xì)節(jié)。其單一主瓣結(jié)構(gòu)減少了成像中的背景噪聲，提高了圖像對比度。在厚樣品中成像時(shí)，高斯光束產(chǎn)生的散射偽影較少，圖像清晰度更高。因此，對于需要高分辨率和高對比度、光敏感或標(biāo)記密集的樣品，高斯光束是理想的選擇。

 

貝塞爾光束

大視野成像的利器

貝塞爾光束通過相位調(diào)制裝置生成，具有自重建特性，能夠在遇到障礙后重建其初始強(qiáng)度分布。這使得貝塞爾光束在較大范圍內(nèi)保持高分辨率成像成為可能。

貝塞爾光束在大視野范圍內(nèi)提供高分辨率成像，特別是在雙光子激發(fā)下，其軸向分辨率顯著提高，適合三維大尺度樣品的成像。然而，貝塞爾光束的旁瓣結(jié)構(gòu)可能引入更多背景信號，降低圖像對比度。對于需要在大范圍內(nèi)保持高分辨率成像的實(shí)驗(yàn)，如三維大尺度樣品成像，貝塞爾光束是最佳選擇。

 

Airy光束

復(fù)雜環(huán)境中的成像專家

Airy光束通過施加立方相位調(diào)制生成，具有“香蕉”形的彎曲形態(tài)和自重建特性，能夠在遇到散射或吸收障礙時(shí)部分恢復(fù)其初始形態(tài)。

Airy光束在復(fù)雜環(huán)境中成像表現(xiàn)優(yōu)異，特別是在高散射介質(zhì)中。盡管其旁瓣增加了光片厚度，可能降低圖像對比度，但在特定應(yīng)用中的優(yōu)勢依然明顯。Airy光束適用于需要在復(fù)雜環(huán)境中成像的實(shí)驗(yàn)，尤其是在高散射介質(zhì)中的應(yīng)用。

 

晶格光束

高時(shí)空分辨率的理想選擇

晶格光束是貝塞爾光束的衍生，利用多個(gè)貝塞爾光束的相干疊加形成。其優(yōu)勢在于提供了更高的時(shí)空分辨率和更好的光片均勻性。

這種光束能夠在較大的視野范圍內(nèi)保持一致的分辨率，但生成復(fù)雜，需要精確的光學(xué)控制。對于需要高時(shí)空分辨率的實(shí)驗(yàn)，如觀察細(xì)胞內(nèi)部動態(tài)過程，晶格光束是理想選擇。

 

聚焦平頂光束

均勻照明的可靠選項(xiàng)

聚焦平頂光束通過均勻照明背焦平面生成，光束在焦平面上形成均勻的亮斑，通常稱為Airy盤。

這種光束在軸向和橫向分辨率之間提供了良好的平衡，適用于需要均勻照明的實(shí)驗(yàn)。雖然生成相對復(fù)雜，但在需要高均勻性的成像應(yīng)用中，聚焦平頂光束表現(xiàn)出色。

 

雙光束

靈活調(diào)控的成像工具

雙光束通過兩個(gè)相互干涉的光束生成，能夠形成交替的亮暗條紋結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)在光片顯微鏡中生成多個(gè)平行光片，增加了成像的靈活性。

雙光束適用于需要高分辨率和大視野成像的應(yīng)用，尤其是需要頻繁調(diào)節(jié)光束參數(shù)的實(shí)驗(yàn)。在復(fù)雜樣品的三維成像中，雙光束能夠提供獨(dú)特的優(yōu)勢。

 

球差光束

應(yīng)對折射率失配的利器

球差光束通過施加球面相位調(diào)制生成，能夠在折射率失配的情況下保持較長的焦深。其優(yōu)勢在于在不同介質(zhì)中保持一致的成像質(zhì)量。

對于需要在不同介質(zhì)中成像的實(shí)驗(yàn)，尤其是需要在透明介質(zhì)和高折射率介質(zhì)之間切換的應(yīng)用，球差光束是理想選擇。

推薦與結(jié)論

綜合考慮不同光束的特性和優(yōu)勢，高斯光束以其高分辨率和高對比度，適用于大多數(shù)成像應(yīng)用；貝塞爾光束在大視野高分辨率成像中表現(xiàn)出色，適合三維大尺度樣品；Airy光束在復(fù)雜環(huán)境中成像具有獨(dú)特優(yōu)勢；晶格光束、聚焦平頂光束、雙光束和球差光束則在特定應(yīng)用中提供了不可替代的優(yōu)勢。

選擇合適的光束類型，將幫助研究人員獲得最佳的成像效果，從而更好地觀察和研究活體培養(yǎng)。光片顯微鏡的光束選擇不僅是技術(shù)的選擇，更是科研成功的關(guān)鍵。