用于探索纖維化過程和治療干預(yù)的心臟組織修復(fù)新工程模型研究

研究背景：
缺血性心臟�。↖HD）影響廣泛，死亡率高，其源于心肌損傷導(dǎo)致的病理重塑，引發(fā)心律失�；蛐牧λソ�。急性心肌梗死后分三階段，凋亡心肌細(xì)胞引發(fā)炎癥，心臟成纖維細(xì)胞活化，纖維化瘢痕取代受損心肌。纖維化瘢痕不僅導(dǎo)致存活心肌機(jī)電耦合降低，還易引發(fā)傳導(dǎo)阻滯，產(chǎn)生折返電脈沖，導(dǎo)致心律失常。人多能干細(xì)胞衍生的心臟譜系細(xì)胞，包括心肌細(xì)胞（CM）、心臟成纖維細(xì)胞（CF）、心外膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，為制造可體外再現(xiàn)成年心肌結(jié)構(gòu)和電生理特征的人類工程心臟組織（hEHT）提供了充足的細(xì)胞保障。球形心臟類器官可以作為 3D 心肌組織來模擬心臟發(fā)育和疾病。目前已有模型取得進(jìn)展，但仍需能準(zhǔn)確代表心肌損傷重塑過程與功能性障礙結(jié)果的體外模型。

基于此，湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、省部共建生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張冬卉教授團(tuán)隊(duì)與上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心張浩教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表了題目為：“Engineered model of heart tissue repair for exploring fibrotic processes and therapeutic interventions”的文章。

研究開發(fā)了一種基于 hEHT 的心肌損傷修復(fù)模型，其重塑過程包括早期 CM 凋亡和結(jié)構(gòu)損傷（0-2天），以及 CF 激活的纖維化瘢痕形成期（2-4天），第 6 天重塑區(qū)域出現(xiàn)電生理功能障礙，表現(xiàn)為鈣波傳導(dǎo)和活性降低。通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鑒定心肌損傷修復(fù)過程中的以心肌細(xì)胞與心臟成纖維細(xì)胞為代表的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變與關(guān)鍵信號(hào)調(diào)控。

接著，在“迷你” hEHT 損傷修復(fù)模型中評(píng)價(jià)十七種信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑，以評(píng)估它們對(duì)心肌重塑的影響。結(jié)果表明，SB431542（TGFβ 抑制劑）、Y27632（ROCK 抑制劑）和 CHIR99021（WNT 激活劑）可防止重塑區(qū)域的過度纖維化并促進(jìn)心肌細(xì)胞的原位修復(fù)。同時(shí)在 hEHT 損傷修復(fù)模型中和小鼠心肌梗死（MI）模型中，進(jìn)一步證實(shí) SB431542（TGFβ 抑制劑）、Y27632（ROCK 抑制劑）和 CHIR99021（WNT 激活劑）根據(jù)重塑進(jìn)展的階段性干預(yù)具備更好的促損傷心肌功能性再生的效果�？傊�，hEHT 修復(fù)模型可模擬心肌重塑、闡明 MI 后電生理功能障礙，有助于篩選治療 IHD 潛在抗纖維化和心臟再生藥物靶點(diǎn)。

研究方法：
本文采用熒光標(biāo)測(cè)技術(shù)（Optical Mapping）來檢測(cè)不同模型組的鈣瞬變信號(hào)。在人類器官模型（hEHT）以及小鼠、大鼠心梗模型中，通過該技術(shù)直觀地描繪出類器官、整體心臟的生理指標(biāo)變化，為心肌損傷修復(fù)機(jī)制以及評(píng)估藥物治療效果提供了重要的檢測(cè)手段。

研究結(jié)果：
1、體外建立 hEHT 損傷修復(fù)模型
通過將人多能干細(xì)胞來源心臟譜系細(xì)胞封裝在纖維蛋白 - 基質(zhì)膠水凝膠中，形成 hEHT 。隨后利用低溫?fù)p傷裝置，建立了 hEHT 損傷修復(fù)模型，該模型能模擬 MI 后損傷心肌的階段性重塑，包括細(xì)胞凋亡、CF 激活和纖維化瘢痕形成等，且能觀察到 CF 遷移和 ECM 分泌，以在后期瘢痕形成期間填充損傷區(qū)域。（圖1）

圖1. hEHT 損傷修復(fù)模型的建立

2、hEHT 損傷修復(fù)模型在纖維化瘢痕形成后表現(xiàn)出與心律失常相關(guān)的電生理功能障礙
其次，心肌梗死（MI）通常會(huì)通過損害 CM 功能和誘導(dǎo)纖維化來引發(fā)心律失常，阻礙心臟電信號(hào)傳播。利用光標(biāo)測(cè)技術(shù)(Optical Mapping)，對(duì)重塑后的 hEHT 進(jìn)行光學(xué)標(biāo)測(cè)，以研究損傷后第 6 天重塑區(qū)域周圍組織水平的鈣波傳播異常。研究結(jié)果表明，重塑區(qū)域中 CF 的填充增加超過 CM，導(dǎo)致異常的鈣活動(dòng)，從而導(dǎo)致傳導(dǎo)阻滯。這些傳導(dǎo)緩慢或傳導(dǎo)阻滯的區(qū)域?qū)⒃黾诱麄�(gè) hEHT 中觸發(fā)折返性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)。大鼠 MI 模型也有類似電生理功能障礙，這表明 hEHT 修復(fù)模型能展示 MI 的損傷發(fā)作、纖維化發(fā)展和功能障礙過程，模擬其時(shí)空景觀。

圖2. 重塑后的 hEHT 存在局部鈣活性異常
 

3、hEHT 損傷修復(fù)模型在重塑過程中由多樣化的細(xì)胞組成
為闡述損傷心肌修復(fù)過程中的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化與關(guān)鍵信號(hào)調(diào)控，對(duì)處于自修復(fù)早期與晚期階段的損傷 hEHT 分別進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。分析結(jié)果表明，hEHT 中存在4種主要細(xì)胞類群，包括心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、心外膜細(xì)胞，心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞，可進(jìn)一步分辨為不同亞群。冷凍損傷激活早期心肌細(xì)胞，特別是非成熟心肌細(xì)胞亞群的缺氧應(yīng)激反應(yīng)及之后的代謝轉(zhuǎn)變。而心臟成纖維細(xì)胞作為心肌病理性重塑的主要原因，損傷增強(qiáng)其向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與 ECM 分泌能力。偽時(shí)序分析進(jìn)一步描繪上皮樣成纖維細(xì)胞 (VIM+/CD44+/CXADR+) 向過渡態(tài)(VIM+/CD44+/CXADR-)演化，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S態(tài)成纖維細(xì)胞(VIM+/CD44-/CXADR-, αSMA+) 的細(xì)胞命運(yùn)。免疫熒光結(jié)果驗(yàn)證上述心臟成纖維細(xì)胞亞群在非損傷區(qū)與重塑區(qū)的空間異質(zhì)性，同樣也發(fā)現(xiàn)心外膜細(xì)胞 (WT1+) 對(duì)于重塑的貢獻(xiàn)，暗示上述細(xì)胞亞群在心肌病理性重塑進(jìn)程中的命運(yùn)聯(lián)系，以及 CD44 對(duì)于心臟成纖維細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變的指示作用。（圖3、圖4）

圖3. 損傷的 hEHT 在重塑過程中的亞細(xì)胞組成和信號(hào)動(dòng)態(tài)的轉(zhuǎn)錄組分析
 

圖4. 偽時(shí)序分析顯示，hEHT 損傷修復(fù)模型中的 CF 在體內(nèi)表現(xiàn)出相似的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變
 

4、用于快速篩選缺血性心臟病潛在治療靶點(diǎn)的“迷你” hEHT 損傷修復(fù)模型
利用 3D 打印制造類似 PCR 管結(jié)構(gòu)的支架用于批量成型直徑約 4 毫米的“迷你” hEHT，通過特定底座可進(jìn)行批量均勻低溫?fù)p傷，其對(duì)損傷反應(yīng)與 hEHT 一致。使用該模型可評(píng)估來自主要涉及到 ROCK、WNT、TGFβ、cAMP、PI3K、ERK、NFκB、前列腺素 E2、成纖維細(xì)胞生長因子共 9 種信號(hào)通路的十七種調(diào)節(jié)劑的促修復(fù)作用，其中一些調(diào)節(jié)劑顯著加速重塑。不同調(diào)節(jié)劑以不同方式加速重塑，表明它們?cè)谀Ｐ椭型ㄟ^獨(dú)立調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞或心臟成纖維細(xì)胞影響重塑結(jié)果。這種迷你版本的人源心肌損傷修復(fù)模型可為缺血性心臟病治療靶點(diǎn)的批量篩選與評(píng)價(jià)提供有力工具。（圖5）

圖5. “迷你” hEHT 損傷修復(fù)模型的建立

5、不同信號(hào)調(diào)節(jié)劑對(duì)“迷你” hEHT 重塑結(jié)果進(jìn)行多維度評(píng)估
接下來，通過分析在第 6 天以心肌細(xì)胞（CM）和心臟成纖維細(xì)胞（CF）標(biāo)記物標(biāo)記的“迷你” hEHT 的 3D 圖像，評(píng)估重塑區(qū)域內(nèi) CM 體積占比、CM 偏心程度及 CF 應(yīng)力纖維長度，以反應(yīng)不同信號(hào)調(diào)節(jié)劑對(duì)迷你 hEHT重塑結(jié)果的影響。最終篩選得到 Y27632、CHIR99021 和 SB431542 在心肌再生和抗纖維化方面比其他治療具有更大的益處。（圖6 ）

圖6. 對(duì)“迷你” hEHT 損傷修復(fù)模型的治療效果評(píng)估

6、用于評(píng)估重塑區(qū)域功能恢復(fù)的綜合評(píng)分系統(tǒng)
為了系統(tǒng)性評(píng)估 Y27632/CHIR99021/TGFβ 對(duì) hEHT 異常電生理功能的修補(bǔ)作用，開發(fā)包含 9 種鈣活動(dòng)特征指標(biāo)的評(píng)分體系，鑒定出Y27632/CHIR99021/TGFβ 依據(jù)重塑進(jìn)程的階段性組合干預(yù)，相較于單因素處理能更好的促進(jìn)瘢痕區(qū)域內(nèi)的異常鈣活動(dòng)恢復(fù)到正常水平。這種階段性組合干預(yù)的優(yōu)越性可能是 Y27632 早期抗凋亡、CHIR99021 促心肌細(xì)胞增殖以及 SB431542 晚期抗纖維化的復(fù)合作用引起的。

圖7. hEHT 修復(fù)模型中對(duì)異常鈣活動(dòng)恢復(fù)的治療效果的綜合評(píng)估

7、心肌梗死小鼠對(duì) Y27632、CHIR99021 和 SB431542 的聯(lián)合治療表現(xiàn)出心臟功能恢復(fù)
新生小鼠心臟有強(qiáng)大再生能力但隨年齡下降。對(duì)新生小鼠進(jìn)行透壁低溫?fù)p傷，驗(yàn)證 Y27632、CHIR99021 和 SB431542 單因素及組合治療效果，聯(lián)合治療可保留心室結(jié)構(gòu)并減少纖維化區(qū)域。在成年小鼠心肌梗死模型中，聯(lián)合治療在治療后 21 天顯著增強(qiáng)心臟功能、減少纖維化區(qū)域，CHIR99021 階段性單因素治療可減少瘢痕形成但不能恢復(fù)功能。階段性干預(yù)促進(jìn)功能恢復(fù)，驗(yàn)證這些藥物的潛在價(jià)值，聯(lián)合治療對(duì)成年梗死小鼠電生理功能障礙效果最佳。（圖8）

圖8. 在成年小鼠心肌梗死模型中，聯(lián)合治療減少纖維化區(qū)域并增強(qiáng)心臟功能

梗死大鼠重塑區(qū)和未損傷區(qū)鈣活性的表征

因此，本文發(fā)現(xiàn)了一種新型的 hEHT 損傷修復(fù)模型，講述了心肌病理性重塑進(jìn)程與信號(hào)調(diào)控，并依據(jù)病程發(fā)展的階段，進(jìn)行階段性信號(hào)調(diào)控策略，為篩選治療 IHD 潛在抗纖維化和心臟再生藥物靶點(diǎn)提供有價(jià)值的參考。