Sfrp1抑制肺成纖維細(xì)胞向損傷誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變期間的侵襲

期刊：European Respiratory Journal
影響因子：16.6
主要技術(shù)：scRNA-seq；空間轉(zhuǎn)錄組；成纖維細(xì)胞

導(dǎo)語
組織纖維化是大多數(shù)主要慢性疾病中最大的未解決的臨床問題之一，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的肌成纖維細(xì)胞是對抗組織纖維化的關(guān)鍵治療靶點。單細(xì)胞RNA測序（scRNAseq）研究描述了小鼠和人肺中不同的膠原生成基質(zhì)細(xì)胞亞群，揭示了它們在支持上皮修復(fù)方面具有不同的空間位置和不同的功能。但成纖維細(xì)胞異質(zhì)性如何導(dǎo)致纖維化疾病尚不清楚。小鼠模型的遺傳譜系追蹤提供了肺損傷后肺泡脂肪成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換的證據(jù)，該轉(zhuǎn)換在完成上皮再生后的短暫纖維化消退過程中是可逆的。肺纖維化中肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞來源的異質(zhì)性仍然是當(dāng)前研究的主題。除了脂肪成纖維細(xì)胞外，肺泡周細(xì)胞也是肌成纖維細(xì)胞的潛在來源。肌成纖維細(xì)胞的增殖、逃避凋亡和侵襲能力是纖維化疾病的關(guān)鍵標(biāo)志，大量文獻證實TGFβ誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中α-平滑肌肌動蛋白（ACTA）2的表達，這是組織中最廣泛使用的成熟肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物。然而，纖維化組織和肌成纖維細(xì)胞病灶的定位和免疫熒光分析也表明，相當(dāng)一部分成纖維細(xì)胞是ACTA2陰性，這表明在損傷激活的成纖維細(xì)胞中存在額外的分子復(fù)雜性和異質(zhì)性。最近對肺纖維化中膠原生成細(xì)胞的單細(xì)胞分析顯示，CTHRC1是高侵襲性ACTA2⁺肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。這些細(xì)胞存在于小鼠和人的肺中，并在特發(fā)性肺纖維化（IPF）中占據(jù)成纖維細(xì)胞灶。

本研究結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)、多重免疫染色、單細(xì)胞測序和遺傳譜系追蹤揭示了不同成纖維細(xì)胞狀態(tài)向CTHRC1⁺肌成纖維細(xì)胞的時空演化，強調(diào)了在肌成纖維細(xì)胞分化之前，損傷誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞激活的早期事件。我們發(fā)現(xiàn)了一種新的Sfrp1⁺ /ACTA2^-過渡狀態(tài)，它最初是非侵襲性的，只有在TGFβ驅(qū)動的向CTHRC1⁺肌成纖維細(xì)胞狀態(tài)的分化時才具有侵襲性。我們發(fā)現(xiàn)Sfrp1調(diào)節(jié)TGFβ1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞侵襲和RHOA通路活性，這構(gòu)成了一個新的途徑，具有靶向肌成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的纖維化疾病的潛力。

技術(shù)服務(wù)
scRNA-seq；空間轉(zhuǎn)錄組；成纖維細(xì)胞

研究結(jié)果
1. 肺間充質(zhì)細(xì)胞在肺部不同空間定位上的異質(zhì)性
為了研究Tcf21⁺和Tcf21⁻成纖維細(xì)胞譜系的異質(zhì)性，我們使用Tcf21m^-Crem^-R26R^-tdTomato小鼠，在11周齡時肺中使用他莫昔芬標(biāo)記Tcf21⁺細(xì)胞。對Tcf21 lin⁺和lin⁻基質(zhì)細(xì)胞進行了流式分類，并進行了scRNAseq （n=4只小鼠，k=12.068個細(xì)胞），鑒定出6種具有不同Tcf21譜系比例的不同細(xì)胞類型（圖1A）。所有細(xì)胞類型均表達1型膠原（Col1a2）。我們確定了三個主要的Pdgfra⁺群體（脂肪成纖維細(xì)胞、胞外基質(zhì)成纖維細(xì)胞、Adh7⁺成纖維細(xì)胞），兩個Pdgfrb⁺群體（平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞）具有高度不同的標(biāo)記基因和途徑富集（圖1B和C），以及最近在腎臟中發(fā)現(xiàn)的Pdgfra/Pdgfrb雙陽性細(xì)胞。這些細(xì)胞表達Lgr5和Lgr6（圖1B），它們是細(xì)支氣管周圍成纖維細(xì)胞群的標(biāo)記物。

接下來，我們使用靶向空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，沿著氣道樹的近端遠端軸，在成年小鼠肺的六個代表性區(qū)域（n=2）中多重定位18個細(xì)胞類型標(biāo)記基因的mRNA（圖1D）。hip⁺/Aspn⁺細(xì)支氣管周圍成纖維細(xì)胞在氣道周圍富集，肺泡內(nèi)也有部分細(xì)胞。Myh11⁺/Acta⁺平滑肌細(xì)胞和serinf1⁺/ cle3b⁺外層成纖維細(xì)胞在氣道和大血管周圍富集。Gucy1a3⁺/Postn⁺周細(xì)胞優(yōu)先定位于肺泡間隙和大血管周圍。Tcf21⁺/Npnt⁺脂肪成纖維細(xì)胞優(yōu)先定位于肺泡間隙（圖1E）。

因此，與Sftpc⁺ AT2細(xì)胞物理接近（直接細(xì)胞間接觸）的細(xì)胞數(shù)量在周細(xì)胞和脂肪成纖維細(xì)胞中最高，一些hip⁺/Aspn⁺細(xì)胞也參與AT2細(xì)胞生態(tài)位（圖1F）。我們的數(shù)據(jù)強調(diào)了AT2細(xì)胞生態(tài)位的復(fù)雜性，在這里證明了它至少包含三種不同的基質(zhì)細(xì)胞類型。

圖 1

2. 以高表達strp1和Col28a1為特征的活化成纖維細(xì)胞狀態(tài)
為了跟蹤損傷和修復(fù)過程中成纖維細(xì)胞的命運，我們對博萊霉素誘導(dǎo)肺損傷后14天的Tcf21^-CremR26R^-tdTomato小鼠的細(xì)胞進行了分選，三個損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞簇變得明顯（圖2A和B），它們是Tcf21譜系陽性和陰性細(xì)胞的混合物。我們鑒定了兩種Cthrc1⁺/Acta2⁺肌成纖維細(xì)胞類型，其中一個亞簇顯示Spp1表達增強（圖2C和D）。一個簇共表達具有不同成纖維細(xì)胞標(biāo)記的肌成纖維細(xì)胞基因，特別是來自脂肪成纖維細(xì)胞；將其命名為“過渡性成纖維細(xì)胞”（圖2B-D），幾個基因包括分泌卷曲相關(guān)蛋白1 (strp1)，在這個假定的中間細(xì)胞群中表現(xiàn)出最高的表達(圖2C和D)。組織蛋白質(zhì)組學(xué)顯示，博來霉素?fù)p傷后COL28A1和Sfrp1蛋白瞬間被誘導(dǎo)。Sfrp1和COL28A1共染色證實在ACTA2低或陰性的移行細(xì)胞中共表達（圖2E），而CTHRC1⁺細(xì)胞表達更高水平的ACTA2（圖2F）。

為了研究臨床相關(guān)性，我們比較了博來霉素?fù)p傷后Col1a2⁺細(xì)胞與ILD患者Col1a2⁺細(xì)胞。Sfrp1特異于COL1A2⁺間充質(zhì)細(xì)胞，在一些CLDN5⁺內(nèi)皮細(xì)胞中表達較弱（圖2G）。表達僅限于表皮成纖維細(xì)胞和疾病富集的“炎癥”成纖維細(xì)胞亞群（圖2G和H）。在所有三個研究隊列中，疾病誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞狀態(tài)下Sfrp1的表達增加是一致的（圖2I和J）。重要的是，在IPF組織中，更多的Sfrp1⁺成纖維細(xì)胞存在于輕度受影響（早期）區(qū)域，而終末期區(qū)域有更多的ACTA2⁺肌成纖維細(xì)胞定位于成纖維細(xì)胞灶（圖2K-M）。這些數(shù)據(jù)表明，在人肺纖維形成中，成纖維細(xì)胞狀態(tài)的軌跡與在博來霉素模型中看到的相似。

圖 2

3. strp1⁺過渡性成纖維細(xì)胞先于Cthrc1⁺肌成纖維細(xì)胞出現(xiàn)
為了跟蹤Col1a2⁺基質(zhì)細(xì)胞在肺炎癥再生期、纖維化期和消退期的轉(zhuǎn)錄動力學(xué)，我們收集了博來霉素?fù)p傷后18個時間點的Epcam−/Pecam1⁻/Lyve1⁻/CD45⁻基質(zhì)細(xì)胞（圖3A-C）。Col1a2⁺細(xì)胞（69185個細(xì)胞）的縱向scRNAseq數(shù)據(jù)集（圖3B）具有三種不同的損傷誘導(dǎo)細(xì)胞狀態(tài)，類似于Tcf21譜系追蹤數(shù)據(jù)集（圖3C）。Strp1⁺移行性成纖維細(xì)胞在第3天達到峰值，在第9天至第21天出現(xiàn)在Spp1⁺和Cthrc1⁺肌成纖維細(xì)胞之前（圖3D）。使用免疫熒光（圖3E-1）發(fā)現(xiàn)在健康的肺中除氣道上皮管腔區(qū)存在非特異性信號外，Sfrp1、CTHRC1和SPP1大部分缺失（圖3E）。COL28A1位于支氣管血管口周圍，而ACTA2主要在氣道和血管附近的平滑肌細(xì)胞中觀察到（圖3E）。損傷后3天，氣道、血管和肺泡周圍出現(xiàn)了Sfrp1/COL28A1雙陽性細(xì)胞，ACTA2在支氣管血管平滑肌細(xì)胞中表達（圖3F、G和J）。損傷后14天，在纖維化致密區(qū)，ACTA2-肌成纖維細(xì)胞和Sfrp1⁺ /COL28A1⁺細(xì)胞共存（圖3H和I）。多重免疫熒光分析證實，第3天，Sfrp1⁺ /COL28A1⁺細(xì)胞增加。直到傷后第14天SPP1⁺和CTHRC1⁺肌成纖維細(xì)胞擴張（圖3K），驗證了我們在蛋白水平上的圖3D的數(shù)據(jù)。

圖 3

4. 多種間充質(zhì)細(xì)胞類型向肌成纖維細(xì)胞身份的趨化
為了推斷不同細(xì)胞類型和激活狀態(tài)之間的譜系關(guān)系，我們使用了CellRank（圖4）分析了三個階段：“早期損傷”（圖4A-C）、“纖維形成”（圖4D-F）和“消退”（圖4G-I）。CellRank熱圖展示了細(xì)胞命運的概率（圖4A、D和G），而小提琴圖則可視化了細(xì)胞之間的概率分布（圖4B、E和H）。散點圖中描繪了與不同命運軌跡相關(guān)的關(guān)鍵譜系驅(qū)動基因（圖4C、F和I）。早期損傷期分析（2-5天）顯示，外層成纖維細(xì)胞和脂肪成纖維細(xì)胞有很高的命運概率過渡到strp1 ⁺狀態(tài)（圖4A、B）。只有少數(shù)Cthrc1⁺肌成纖維細(xì)胞（圖4A和B）。遷移細(xì)胞的top驅(qū)動基因包括各種膠原、趨化因子，尤其是strp1，而肌成纖維細(xì)胞譜系顯示的標(biāo)記基因包括Tnc、Spp1和Thbs1（圖4C）。在纖維形成階段（第6天至第21天），CellRank預(yù)測了strp1 ⁺細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變（圖4D、E）。肌成纖維細(xì)胞的頂級驅(qū)動基因代表了經(jīng)典的肌成纖維細(xì)胞相關(guān)基因，包括Lgals1、Sparc和Spp1以及Cthrc1（圖4F）。在分化階段，分化概率表明Cthrc1⁺肌成纖維細(xì)胞向脂肪成纖維細(xì)胞、細(xì)支氣管周圍成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)。這一預(yù)測與之前觀察到的脂肪生成和肌生成成纖維細(xì)胞表型之間的雙向轉(zhuǎn)換有關(guān)。

圖 4

接下來，我們發(fā)現(xiàn)25種不同的膠原在損傷后或不同基質(zhì)細(xì)胞之間具有動態(tài)表達模式（圖5A）。此外，還鑒定出90個分泌的基質(zhì)基因，它們在損傷時間過程中表達發(fā)生了顯著變化（圖5B）。所有細(xì)胞類型均表現(xiàn)出i型膠原（Col1a2）和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物ECM蛋白Sparc的短暫表達增加（圖5C）。我們還觀察到常見的早期成纖維細(xì)胞激活事件，如損傷后早期S100a6的上調(diào)（圖5C）。細(xì)支氣管周圍成纖維細(xì)胞特別具有重要的分泌形態(tài)因子，如hip、Wif1、Fgf18和Wnt5a（圖5D）。成纖維細(xì)胞衍生的Wnt信號，尤其是Wnt5a，在正常穩(wěn)態(tài)下定義了一個特定的AT2細(xì)胞生態(tài)位，是人類遠端氣道中一個獨特的間質(zhì)生態(tài)位的一部分，由Lgr5⁺成纖維細(xì)胞分泌。除了損傷誘導(dǎo)的趨化因子如用于B細(xì)胞募集的Cxcl13，以及用于吸引T細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的Cxcl12和Ccl8外，內(nèi)皮成纖維細(xì)胞特異性地產(chǎn)生Wnt調(diào)節(jié)劑Strp4。有趣的是，趨化因子eotaxin （Ccl11）特異性標(biāo)記了不受損傷影響的內(nèi)皮成纖維細(xì)胞（圖5E）。脂肪成纖維細(xì)胞特異性表達形態(tài)因子Wnt2和Bmp3，以及干細(xì)胞因子（SCF） （Kitl）（圖5F）。在博萊霉素?fù)p傷的肺中，SCF-c-Kit通路被激活，通過向肺募集Kit⁺免疫細(xì)胞，具有潛在的促纖維化作用。

最后，我們的數(shù)據(jù)表明，損傷后早期，多種間充質(zhì)細(xì)胞類型會聚為strp1⁺遷移細(xì)胞，最終產(chǎn)生Cthrc1⁺肌成纖維細(xì)胞，并有可能在消退期恢復(fù)為脂肪成纖維細(xì)胞、細(xì)支氣管周圍成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞。
 

圖 5

5. TGFβ介導(dǎo)strp1⁺過渡性成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化
為了推斷損傷后成纖維細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的潛在調(diào)節(jié)因子，我們使用了NicheNet，它預(yù)測了最有可能誘導(dǎo)Sfrp1⁺遷移細(xì)胞和Cthrc1⁺肌成纖維細(xì)胞CellRank輸出中頂層驅(qū)動基因表達的配體（圖6A和B）。Sfrp1⁺遷移細(xì)胞上游的頂層配體是Notch配體Jag1，主要在分泌性氣道上皮細(xì)胞中表達。肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖6A）也有較小程度的影響。與我們的發(fā)現(xiàn)一致，據(jù)報道，在博來霉素模型中，間充質(zhì)細(xì)胞中Notch缺失會減少纖維化重構(gòu)和肌成纖維細(xì)胞分化。值得注意的是，在Strp1⁺遷移細(xì)胞狀態(tài)驅(qū)動基因的上游，頂級配體排除了TGFβ，而TGFβ是Cthrc1⁺肌成纖維細(xì)胞驅(qū)動基因的頂級配體。TGFβ1是頂配體，主要由髓系免疫細(xì)胞表達，TGFβ3由活化的AT2細(xì)胞和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表達（圖6B）。

在體外培養(yǎng)分離的原代小鼠和人肺成纖維細(xì)胞時，我們觀察到標(biāo)記基因的表達與體內(nèi)的Strp1⁺過渡狀態(tài)一致（圖6C和D）。TGFβ1刺激后，SPP1和纖維化相關(guān)ECM標(biāo)志物fn1上調(diào)，而Sfrp1下調(diào)（圖6D）。我們使用定量PCR（圖6E）、免疫熒光（圖6F和G）和Western blot（圖6I-K）在人和小鼠原代肺成纖維細(xì)胞中驗證了這些觀察結(jié)果。因此，我們驗證了我們的計算預(yù)測，證明TGFβ1是原代成纖維細(xì)胞中控制Sfrp1和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物表達的主開關(guān)。
 

圖 6

6. Sfrp1調(diào)節(jié)TGFβ1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞侵襲和RHOA活性
分泌的Sfrp1是Wnt信號通路的抑制劑并調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲。之前發(fā)現(xiàn)膠原侵入肺成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，其特征是Strp1表達的顯著降低。在纖維形成過程中，被激活的成纖維細(xì)胞被認(rèn)為遷移到受損組織區(qū)域形成纖維化灶。博來霉素?fù)p傷后小鼠肺移植實驗表明，與其他成纖維細(xì)胞狀態(tài)相比，Cthrc1⁺肌成纖維細(xì)胞具有更強的遷移能力。為了檢驗Sfrp1在成纖維細(xì)胞侵襲中的作用，我們在來自四個供體的pHLFs中缺失了Sfrp1，并進行了膠原侵襲試驗和轉(zhuǎn)錄組分析（圖7A和B）。與對照組相比，Sfrp1缺失細(xì)胞的侵襲能力顯著增強，與TGFβ1治療相似（p<0.001）（圖7C）。Sfrp1-siRNA和TGFβ1聯(lián)合處理產(chǎn)生了逆轉(zhuǎn)表型，阻止了TGFβ1誘導(dǎo)的侵襲。值得注意的是，在未處理的Sfrp1敲除細(xì)胞中，侵襲增加，而在TGFβ1刺激的細(xì)胞中，侵襲減少，通過重組Sfrp1至少部分恢復(fù)，表明Sfrp1依賴通路調(diào)節(jié)TGFβ1驅(qū)動的成纖維細(xì)胞表型（圖7D）。對Sfrp1缺失成纖維細(xì)胞的大量轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，RHOA信號相關(guān)通路的下調(diào)可能是通過上調(diào)RhoGDI抑制信號來實現(xiàn)的（圖7E）。

我們證實RHOA mRNA表達減少（圖7F）， RHOA- gtpase活性降低（圖7G）。此外，Sfrp1敲低誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)改變?yōu)榧?xì)長細(xì)胞形狀（圖7H和圖I）。為了測試RhoA抑制如何影響成纖維細(xì)胞侵襲，我們在Sfrp1缺失和對照細(xì)胞中使用RhoA抑制劑CT04，發(fā)現(xiàn)單獨使用CT04顯著增加細(xì)胞侵襲（圖7J）。然而，我們確實發(fā)現(xiàn)CT04在Sfrp1缺乏的細(xì)胞中對細(xì)胞侵襲有一個小而顯著的加性作用，這表明并非所有的Sfrp1對細(xì)胞侵襲的調(diào)節(jié)作用都嚴(yán)格依賴于RHOA途徑（圖7J）。綜上所述，我們在pHLFs中的功能喪失實驗揭示了Sfrp1通過調(diào)節(jié)RHOA途徑部分調(diào)節(jié)TGFβ1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞侵襲的功能。
 

圖 7

結(jié)論
成纖維細(xì)胞是組織平衡、免疫反應(yīng)和傷口愈合的主導(dǎo)者。我們在細(xì)支氣管周圍的特定組織中描繪了成纖維細(xì)胞譜系的損傷誘導(dǎo)激活狀態(tài)。縱向單細(xì)胞和譜系追蹤實驗揭示了一種新的遷移細(xì)胞狀態(tài)和高度細(xì)胞類型和譜系特異性的旁分泌信號，介導(dǎo)了肺再生的特殊功能。我們的分析進一步表明，在肺纖維化的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，Sfrp1是TGFβ1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑（圖8）。目前的IPF/ILD發(fā)病模式涉及與特定遺傳因素相關(guān)的異常和持續(xù)修復(fù)。博來霉素小鼠模型可能更準(zhǔn)確地概括了IPF/ILD發(fā)病的早期階段，并在疾病進展的后期階段失去相關(guān)性。事實上，我們發(fā)現(xiàn)在博來霉素?fù)p傷后的早期階段和IPF外植體中輕度受影響區(qū)域的Sfrp1⁺遷移性成纖維細(xì)胞有有趣的相似性。這表明，在反映ILD/IPF早期階段的博來霉素小鼠模型中，成纖維細(xì)胞激活狀態(tài)具有高度的臨床相關(guān)性。
 

圖 8

我們在Tcf21^-Cre報告小鼠的肺上使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)來解決脂肪成纖維細(xì)胞的譜系軌跡。然而，局限性在于除了hip⁺細(xì)支氣管周圍成纖維細(xì)胞外，所有其他間充質(zhì)細(xì)胞類型也由于低水平的Tcf21表達而被標(biāo)記為譜系。先前的研究證實，成纖維細(xì)胞侵襲有助于肺纖維化的進展和嚴(yán)重程度。我們在這里發(fā)現(xiàn)，損傷激活的成纖維細(xì)胞的早期Strp1⁺過渡狀態(tài)是非侵入性的，這表明損傷激活的成纖維細(xì)胞具有局部小眾功能，如通過外表皮成纖維細(xì)胞募集免疫細(xì)胞，或通過脂肪成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞和hip⁺成纖維細(xì)胞激活上皮干細(xì)胞。我們的細(xì)胞侵襲數(shù)據(jù)表明，在pHLFs中，Sfrp1的可用性決定了TGFβ1是否誘導(dǎo)前侵襲或抗侵襲行為。在IPF等病理中，肌成纖維細(xì)胞侵入并將自身組織成致密的聚集體，稱為成纖維細(xì)胞灶，這一過程也在博來霉素模型中得到了概括。因此，本研究中發(fā)現(xiàn)的機制對IPF開辟了新的治療干預(yù)途徑，對應(yīng)限制或逆轉(zhuǎn)成纖維細(xì)胞灶的形成具有直接意義。

參考文獻：
Mayr CH, Sengupta A, Asgharpour S, Ansari M, Pestoni JC, Ogar P, Angelidis I, Liontos A, Rodriguez-Castillo JA, Lang NJ, Strunz M, Porras-Gonzalez D, Gerckens M, De Sadeleer LJ, Oehrle B, Viteri-Alvarez V, Fernandez IE, Tallquist M, Irmler M, Beckers J, Eickelberg O, Stoleriu GM, Behr J, Kneidinger N, Wuyts WA, Wasnick RM, Yildirim AÖ, Ahlbrecht K, Morty RE, Samakovlis C, Theis FJ, Burgstaller G, Schiller HB. Sfrp1 inhibits lung fibroblast invasion during transition to injury-induced myofibroblasts. Eur Respir J. 2024 Feb 8;63(2):2301326. doi: 10.1183/13993003.01326-2023. PMID: 38212077; PMCID: PMC10850614.