泰樂菌素檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）

 
1、 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，檢測禽類組織、蜂蜜等樣本中的泰樂菌素含量。試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的泰樂菌素和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗泰樂菌素抗體，再與酶標(biāo)記物形成抗原抗體復(fù)合物，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其泰樂菌素含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較乘以樣本稀釋倍數(shù)即可得出樣本中泰樂菌素的殘留量。

2、 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
禽組織…………………………1ppb
蜂蜜…………………………0.5ppb
禽蛋、牛奶…………………25ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
泰樂菌素 ………………………100%
紅霉素………………………… 1%
與其他大環(huán)內(nèi)酯類藥物交叉反應(yīng)小于1%
 2.5 樣本回收率：
組織…………………………………85±10%
蜂蜜、禽蛋、牛奶…………………85±15%

3、 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml
0ppb、0.5ppb、1.5 ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………11ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）…………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
2×復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
說明書…………………………………1份
蓋板膜…………………………………1張
自封袋…………………………………1個(gè)

4、 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、振蕩器、氮?dú)獯蹈裳b置、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：NaOH、甲醇、濃HCl、乙腈、三氯甲烷、正己烷

5、 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液：
樣本前處理需配制：
配液1：0.1M  NaOH
0.4g NaOH 加去離子水混勻溶解，定容至100ml。
配液2：0.01M  NaOH
0.4g NaOH 加去離子水混勻溶解，定容至1L。
配液3：0.1M  HCL
    8.6mL濃HCL加去離子水混勻，定容至1L。
配液4：樣本提取液（乙腈-0.1M HCl）—甲醇溶液
取乙腈84ml先加入0.1M HCl 16ml混勻后，再加入18ml甲醇混勻。
配液5：復(fù)溶液
2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋（1份2×復(fù)溶液加1份去離子水）
配液6：工作洗滌液
    將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。
5.3.1 禽組織處理方法 
1） 稱取均質(zhì)樣本2±0.05g于50ml離心管中，加入8ml樣本提取液，用振蕩器振蕩5分鐘；4000轉(zhuǎn)/分以上,室溫離心10分鐘；
2） 取上清液2ml，加入0.1M NaOH溶液1ml,混合后加入 3ml三氯甲烷萃取，振蕩器上振蕩5分鐘；4000轉(zhuǎn)/分以上，室溫離心10分鐘。
3）去除上層相，取下層全部有機(jī)相至干凈玻璃試管中，于56℃水浴下氮?dú)?空氣吹干；
4） 用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥后的殘留物，混合30s；
5） 取50ul用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：2        檢測下限：1ppb
5.3.2 蜂蜜處理方法
1）稱取1±0.05g樣本于50ml離心管中，加2ml去離子水渦動(dòng)2分鐘使其溶解；
2）再加入10ml三氯甲烷上下振蕩5分鐘，4000轉(zhuǎn)/分，室溫離心10分鐘。
3） 去除上層相，取下層全部有機(jī)相至干凈玻璃試管中，于56℃水浴下氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?br /> 4） 用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥后的殘留物，混合30s；
5） 取50ul用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1      檢測下限：0.5ppb
5.3.3 禽蛋處理方法
1） 將禽蛋打破去皮勻漿后取1g±0.05g于15ml離心管中，加入0.01M NaOH 4ml，振蕩2分鐘，室溫4000r/分離心10分鐘；
2） 取上層液體2ml于15ml離心管中，加入4ml正己烷，振蕩2分鐘，室溫4000r/分離心10分鐘；
3） 去除上層正己烷，小心穿過中間層淺黃色果凍狀物質(zhì)取下層清液0.1ml于1.5ml離心管中，再加入0.9ml稀釋后的復(fù)溶液，振蕩混勻30s,取50ul分析。
樣本稀釋倍數(shù)：50      檢測下限：25ppb
5.3.4 牛奶處理方法
1）取0.5ml牛奶于15ml離心管中，加入0.01M NaOH 2ml，振蕩2分鐘，室溫4000r/分離心10分鐘；
2）取上層液體1ml于15ml離心管中，加入2ml正己烷，振蕩2分鐘，室溫4000r/分離心10分鐘；
3）去除上層正己烷，小心穿過中間層果凍狀物質(zhì)取下層清液0.1ml于1.5ml離心管中，再加入0.9ml稀釋后的復(fù)溶液，振蕩混勻30s,取50ul分析。
樣本稀釋倍數(shù)：50      檢測下限：25ppb 

6、 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干。（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔，25℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.5 洗    滌：同上
6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間）。
6.7 終    止：加終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.8 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7、 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）＝	A	×100%
	A0

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）

8、 注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。           

9、 貯藏及保存期
儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。