ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗操作中的各影響因素分析
ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗是目前臨床上最常用的免疫學(xué)檢驗方法，由于其試劑穩(wěn)定，易保存，操作簡便，結(jié)果判斷較客觀，既適宜于大規(guī)模篩查試驗，又可用于少量標(biāo)本的檢測，既可以做定性試驗也可以做定量分析，目前已廣泛用于微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、腫瘤學(xué)和細胞因子檢測等領(lǐng)域。ELISA 有敏感性高，特異性強，重復(fù)性好的特點，但其同時存在影響因素多的不足，現(xiàn)就實驗操作中常見的影響因素進行分析實驗，以提高的實驗質(zhì)量。
1、樣品
樣品是檢測的前提，樣品質(zhì)量會直接影響實驗結(jié)果�？梢杂肊LISA來檢測的樣品很多，根據(jù)檢測項目不同可以是血清、血漿、唾液、尿液等，但大部分還是以血清為樣品。作為血清樣品，應(yīng)避免溶血，溶血可能會增加非特異性顯色，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)誤差。
血清樣品的反復(fù)凍融會使血清中的抗體效價下降，所以需要多次檢測的血清樣品，如在5d內(nèi)檢測完，可4℃保存，如需長時間檢測，可進行分裝凍存。樣品如被細菌污染腐敗，可能會導(dǎo)致假陽性。
2、溫度
溫度主要影響抗原抗體反應(yīng)，酶促反應(yīng)速度及非特異性吸附，溫度升高可使抗原抗體結(jié)合反應(yīng)加速，但也易引起抗原抗體復(fù)合物的解離。酶促反應(yīng)速度同樣隨溫度升高而增快，但是酶蛋白變性也加快，喪失酶學(xué)活性，降低酶的有效濃度而減慢反應(yīng)速度，溫度低時以前者為主，高時以后者為主。
溫度是質(zhì)量控制的一個重要方面，一般允許±1℃的誤差。最好水浴，微孔板浮在水面，使溫度迅速平衡。如放溫箱內(nèi)溫育，微孔板不應(yīng)疊置，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，盛放微孔板的濕盒應(yīng)是金屬的，傳熱容易。空濕盒應(yīng)預(yù)先放在溫箱中，以平衡溫度，在室溫較低時更需要。
3、時間
在溫度保證的前提下，時間的控制至關(guān)重要，尤其是底物顯色的時間控制，顯色時間不足或過長會導(dǎo)致實驗不成立，無法對檢測結(jié)果進行判斷。
加人標(biāo)本、試劑及混合的時間稱為操作時差。操作時差在每個試驗中都存在，對結(jié)果或多或少有影響。對手工操作，尤其是樣品量大的項目，從加人第一個標(biāo)本到最后一個標(biāo)本，需幾十分鐘，加人試劑及混勻存在很大的時間差異，使抗原抗體和酶促反應(yīng)時間不一致，易產(chǎn)生假陽性、假陰性結(jié)果。
因此，樣品過多時，請選擇分批操作，對勿須更換移液口吸嘴的酶結(jié)合物，底物的加樣可選擇8聯(lián)或12聯(lián)專用的多道加液器。亦可避免單孔滴加底物時遺漏多加。
4、人員操作
ELISA成品試劑盒為檢測工作提供了方便，按照說明書進行操作就可以完成實驗，但人為操作時候很多細節(jié)也會導(dǎo)致實驗誤差。
1）. 包被
一些ELISA反應(yīng)板需要自行進行包被處理，沒有進行包被，或包被液使用與檢測項目不同都會使實驗失敗。包被時，未進行震蕩，孔底未被包被液全部覆蓋會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差。
2）. 反應(yīng)液稀釋
稀釋液使用錯誤或稀釋比例不正確會導(dǎo)致實驗失敗或結(jié)果不準(zhǔn)確。
3）. 洗板
人工洗板時，棄去洗滌液時方法不當(dāng)，易使各孔液體相互流入，導(dǎo)致假陽性；洗滌液使用量和洗滌次數(shù)過少導(dǎo)致洗滌不徹底，洗板后未拍板或拍不干凈都會影響實驗結(jié)果。
5、設(shè)備
儀器設(shè)備是ELISA實驗的基礎(chǔ)，常用的相關(guān)儀器設(shè)備包括移液器、酶標(biāo)儀、洗板機和恒溫箱等。所有設(shè)備都需要進行檢驗校準(zhǔn)，保證準(zhǔn)確性和精確度。
移液器的使用要盡可能選擇所需加液量接近最大量程，并正確使用，減少實驗誤差。
酶標(biāo)儀要提前開機預(yù)熱，保證光源穩(wěn)定；洗板機要檢查加液孔是否通暢，保證加液量。
恒溫箱要提前開機，開、關(guān)門要快速，保證反應(yīng)溫度。
6、試劑
試劑盒要根據(jù)要求進行保存，并保證在有效期內(nèi)使用，使用前應(yīng)平衡到室溫。新購入的試劑盒要進行校驗，檢查實驗是否成立，不同的試劑盒或不同批號的試劑不可混用。
7、顯色
顯色是ELISA中的最后一步反應(yīng),此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行。
在定量測定中,加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴(yán)格控制,有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延。
8、其他
封板膜封閉不嚴(yán)或開啟時孔內(nèi)液體蒸發(fā)、震出可導(dǎo)致各孔相互污染；操作時接觸到ELISA板底導(dǎo)致透光度改變，影響酶標(biāo)儀測量結(jié)果；
加樣圖省事，未認真更換移液器吸頭，認為其帶入標(biāo)本殘留量小，不易影響結(jié)果，是部分檢測人員常有的心理。因此加標(biāo)本時必須認真更換移移液器吸頭，防止移液器吸頭殘留痕量產(chǎn)生假陽性結(jié)果。加樣時應(yīng)防止濺出污染其它標(biāo)本。
9、比色測定
ELISA的比色測定由酶標(biāo)儀進行測定，故需強調(diào)比色測定時，一定要注意酶標(biāo)儀的波長是否是雙波長（450nm和630nm）。
1、樣品
樣品是檢測的前提，樣品質(zhì)量會直接影響實驗結(jié)果�？梢杂肊LISA來檢測的樣品很多，根據(jù)檢測項目不同可以是血清、血漿、唾液、尿液等，但大部分還是以血清為樣品。作為血清樣品，應(yīng)避免溶血，溶血可能會增加非特異性顯色，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)誤差。
血清樣品的反復(fù)凍融會使血清中的抗體效價下降，所以需要多次檢測的血清樣品，如在5d內(nèi)檢測完，可4℃保存，如需長時間檢測，可進行分裝凍存。樣品如被細菌污染腐敗，可能會導(dǎo)致假陽性。
2、溫度
溫度主要影響抗原抗體反應(yīng)，酶促反應(yīng)速度及非特異性吸附，溫度升高可使抗原抗體結(jié)合反應(yīng)加速，但也易引起抗原抗體復(fù)合物的解離。酶促反應(yīng)速度同樣隨溫度升高而增快，但是酶蛋白變性也加快，喪失酶學(xué)活性，降低酶的有效濃度而減慢反應(yīng)速度，溫度低時以前者為主，高時以后者為主。
溫度是質(zhì)量控制的一個重要方面，一般允許±1℃的誤差。最好水浴，微孔板浮在水面，使溫度迅速平衡。如放溫箱內(nèi)溫育，微孔板不應(yīng)疊置，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，盛放微孔板的濕盒應(yīng)是金屬的，傳熱容易。空濕盒應(yīng)預(yù)先放在溫箱中，以平衡溫度，在室溫較低時更需要。
3、時間
在溫度保證的前提下，時間的控制至關(guān)重要，尤其是底物顯色的時間控制，顯色時間不足或過長會導(dǎo)致實驗不成立，無法對檢測結(jié)果進行判斷。
加人標(biāo)本、試劑及混合的時間稱為操作時差。操作時差在每個試驗中都存在，對結(jié)果或多或少有影響。對手工操作，尤其是樣品量大的項目，從加人第一個標(biāo)本到最后一個標(biāo)本，需幾十分鐘，加人試劑及混勻存在很大的時間差異，使抗原抗體和酶促反應(yīng)時間不一致，易產(chǎn)生假陽性、假陰性結(jié)果。
因此，樣品過多時，請選擇分批操作，對勿須更換移液口吸嘴的酶結(jié)合物，底物的加樣可選擇8聯(lián)或12聯(lián)專用的多道加液器。亦可避免單孔滴加底物時遺漏多加。
4、人員操作
ELISA成品試劑盒為檢測工作提供了方便，按照說明書進行操作就可以完成實驗，但人為操作時候很多細節(jié)也會導(dǎo)致實驗誤差。
1）. 包被
一些ELISA反應(yīng)板需要自行進行包被處理，沒有進行包被，或包被液使用與檢測項目不同都會使實驗失敗。包被時，未進行震蕩，孔底未被包被液全部覆蓋會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差。
2）. 反應(yīng)液稀釋
稀釋液使用錯誤或稀釋比例不正確會導(dǎo)致實驗失敗或結(jié)果不準(zhǔn)確。
3）. 洗板
人工洗板時，棄去洗滌液時方法不當(dāng)，易使各孔液體相互流入，導(dǎo)致假陽性；洗滌液使用量和洗滌次數(shù)過少導(dǎo)致洗滌不徹底，洗板后未拍板或拍不干凈都會影響實驗結(jié)果。
5、設(shè)備
儀器設(shè)備是ELISA實驗的基礎(chǔ)，常用的相關(guān)儀器設(shè)備包括移液器、酶標(biāo)儀、洗板機和恒溫箱等。所有設(shè)備都需要進行檢驗校準(zhǔn)，保證準(zhǔn)確性和精確度。
移液器的使用要盡可能選擇所需加液量接近最大量程，并正確使用，減少實驗誤差。
酶標(biāo)儀要提前開機預(yù)熱，保證光源穩(wěn)定；洗板機要檢查加液孔是否通暢，保證加液量。
恒溫箱要提前開機，開、關(guān)門要快速，保證反應(yīng)溫度。
6、試劑
試劑盒要根據(jù)要求進行保存，并保證在有效期內(nèi)使用，使用前應(yīng)平衡到室溫。新購入的試劑盒要進行校驗，檢查實驗是否成立，不同的試劑盒或不同批號的試劑不可混用。
7、顯色
顯色是ELISA中的最后一步反應(yīng),此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行。
在定量測定中,加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴(yán)格控制,有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延。
8、其他
封板膜封閉不嚴(yán)或開啟時孔內(nèi)液體蒸發(fā)、震出可導(dǎo)致各孔相互污染；操作時接觸到ELISA板底導(dǎo)致透光度改變，影響酶標(biāo)儀測量結(jié)果；
加樣圖省事，未認真更換移液器吸頭，認為其帶入標(biāo)本殘留量小，不易影響結(jié)果，是部分檢測人員常有的心理。因此加標(biāo)本時必須認真更換移移液器吸頭，防止移液器吸頭殘留痕量產(chǎn)生假陽性結(jié)果。加樣時應(yīng)防止濺出污染其它標(biāo)本。
9、比色測定
ELISA的比色測定由酶標(biāo)儀進行測定，故需強調(diào)比色測定時，一定要注意酶標(biāo)儀的波長是否是雙波長（450nm和630nm）。
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