單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示骨肉瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制和微環(huán)境重塑中的應(yīng)用

期刊：BMC Medicine
影響因子：11.8
主要技術(shù)：scRNA‐seq，空間轉(zhuǎn)錄組，免疫組化

導(dǎo)語(yǔ)
骨肉瘤 （OS） 是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤，極易轉(zhuǎn)移。OS 可通過(guò)淋巴管轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié) （LN），腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移重建了 LN 的免疫景觀，有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而，骨肉瘤 LN 轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié) （MLN） 微環(huán)境重塑的機(jī)制尚不清楚。從 18 個(gè)單細(xì)胞測(cè)序樣本中，我們獲得了 117,964 個(gè)細(xì)胞。擬時(shí)間分析顯示，在 LN 轉(zhuǎn)移過(guò)程中，成骨細(xì)胞 （OB） 細(xì)胞可能遵循從癌旁組織 （PC） →原發(fā)腫瘤 （PT） → MLN 或從 PC → PT 分化的路徑。接下來(lái)，結(jié)合生生信分析、體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及免疫組化，確定新 ETS2/IBSP 可能會(huì)促進(jìn) LN 轉(zhuǎn)移。OS 細(xì)胞可以通過(guò)與各種細(xì)胞成分相互作用來(lái)重塑 LN 的微環(huán)境，例如骨髓、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 （CAF） 和 NK/T 細(xì)胞。

技術(shù)服務(wù)
scRNA‐seq，空間轉(zhuǎn)錄組，免疫組化

研究結(jié)果
1. 骨肉瘤單細(xì)胞圖譜
為了研究發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過(guò)程，本研究收集了 18 份樣本，包括 8 例原發(fā)性腫瘤 （PT） 、4 例癌旁 （PC） 和 6 例淋巴結(jié) （LN）。此外，為了驗(yàn)證 LN 中微環(huán)境的變化，對(duì)兩個(gè) MLN 進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（圖 D）。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，最終獲得總共 117,964 個(gè)細(xì)胞，并將其分為 7 種細(xì)胞類型（圖 1B）。根據(jù)標(biāo)記基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞群進(jìn)行注釋如下：髓樣細(xì)胞 （LY Z ， S100A9 ， C1QA ， CD68 ， APOE）;T 細(xì)胞 （CD3D、CD3E、CD3G、TRAC）;成纖維細(xì)胞 （CAF） （FBLN1、ACTA2、TAGLN、COL3A1、COL6A1）;成骨細(xì)胞 （OB 細(xì)胞） （ALPL、RUNX2 CLEC11A）;B 細(xì)胞 （CD79A、MS4A1、IGHM、CD19）;NKT 細(xì)胞 （NKG7， GZMK， GZMA， GZMB， CD3D， CD3E， CD3G， TRAC）;內(nèi)皮細(xì)胞（VWF、C AV 1、CLDN5、EGFL7、PECAM1）（圖 1C）。在本研究中檢測(cè)到的所有細(xì)胞中，T 細(xì)胞和髓樣細(xì)胞最豐富，其次是 CAF 和 OB（成骨細(xì)胞）細(xì)胞（圖 D）。OB 細(xì)胞主要分布在 MLN 和 PT 中，而 T 細(xì)胞和 NKT 細(xì)胞主要分布在 LN 中（圖 1E）。

2.骨肉瘤進(jìn)展過(guò)程中成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征
為了鑒定惡性細(xì)胞的克隆結(jié)構(gòu)和細(xì)胞來(lái)源，使用 inferCNV 算法分析了 MLN、LN 和 PT 樣本中 OB 細(xì)胞的 CNV 和克隆性。我們選擇 PC 樣本中的 OB 細(xì)胞作為參考，因?yàn)?PC 成骨細(xì)胞被認(rèn)為是良性的。結(jié)果顯示，PT 和 MLN 樣本中的 OB 細(xì)胞在除 10 、 13 和 21 號(hào)染色體外的大多數(shù)染色體上表現(xiàn)出基因拷貝數(shù)增加，表明 PT 和 MLN 中的 OB 細(xì)胞是惡性骨肉瘤細(xì)胞 （OS 細(xì)胞）。相比之下，LN 中的 OB 細(xì)胞具有與參考細(xì)胞相似的拷貝數(shù)，表明它們是良性的（圖 2A）。因此，PT 和 MLN 中的 OB 細(xì)胞被鑒定為惡性腫瘤細(xì)胞，即骨肉瘤細(xì)胞 （OS 細(xì)胞）。隨后，我們檢測(cè)了 PC、PT 和 MLN 中成骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)豐度。結(jié)果顯示 ALPL 、 RUNX2 和 CLEC11A 在 PC 中低表達(dá)，而在 PT 和 MLN 中高表達(dá) （均 p< 0.05，Wilcoxon 檢驗(yàn)），這表明腫瘤進(jìn)展過(guò)程中 OB 細(xì)胞異常激活和惡性轉(zhuǎn)化 （圖 2B）。我們還對(duì)患者 7 進(jìn)行了擬時(shí)間分析，同時(shí)收集了 PC 、 PT 和 MLN�？梢钥闯觯�患者 7 的結(jié)果與混合樣本的結(jié)果相似。這表明，在 LN 轉(zhuǎn)移過(guò)程中，OB 細(xì)胞可能遵循從 PC →PT → MLN（狀態(tài) 3）或 PC→PT（狀態(tài) 2）的分化路徑（圖 2）。2C，附加文件 5：圖 S1）。許多基因在狀態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程中表現(xiàn)出差異表達(dá)，表明這些基因可能介導(dǎo) OS 的發(fā)病機(jī)制和 LN 轉(zhuǎn)移 （圖 2D）。此外，還介紹了各種組織中排名前 5 位的差異表達(dá)基因。這些基因可能參與 OS 的發(fā)病機(jī)制和轉(zhuǎn)移，需要進(jìn)一步研究 （圖 2E）。
 

3.ETS2 通過(guò) IBSP 介導(dǎo) LN 轉(zhuǎn)移
為了進(jìn)一步探索轉(zhuǎn)移的機(jī)制，我們將 OB 細(xì)胞細(xì)分為 7 個(gè)不同的亞組（圖3A）。來(lái)自不同來(lái)源的樣品中的 OB 細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)它們之間存在顯著的異質(zhì)性（圖 D）。為了闡明 OB 細(xì)胞不同亞群的功能，我們對(duì)每個(gè)亞群的差異表達(dá)基因進(jìn)行了 GSVA 分析。結(jié)果顯示，C6 簇中的差異表達(dá)基因在 DNA_REPAIR、 NOTCH_ SIGNALING_PATHWAY、 WNT_SIGNALING_PATHWAY 和 PI3K_AKT_MTOR_SIGNALING 等與轉(zhuǎn)移相關(guān)的通路中顯著富集。C6 簇的 lls 被認(rèn)為是最有可能執(zhí)行遷移和侵襲功能的亞群（圖 3C）。為了進(jìn)一步確認(rèn) C6 亞組與 OS 轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)，我們編譯了先前報(bào)道與 OS 轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，并使用 AddModuleScore 使用這些基因?qū)γ總�(gè)亞組進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果顯示 C6 亞組得分最高，表明 C6 亞組與轉(zhuǎn)移 （Fig. 3D） 關(guān)系最密切。使用 AUCell 時(shí)，類似的結(jié)果也適用（附加文件 6：圖 S2C）。為了鑒定 C6 簇中的樞紐基因，我們交叉了以下三個(gè)基因集：與 PT 的 C6 相比，在 MLN 的 C6 中高度表達(dá)的基因 （MLN_C6 vs PT_C6），與 MLN 中的其他亞組相比，在 C6 中高度表達(dá)的基因 （C6 vs other_clusters），以及與 PC 的 OB 相比，在 PT 的 OB 中高度表達(dá)的基因 （PT vs PC）。獲得了 16 個(gè)樞紐基因（圖3E）。在 TARGET 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)這些候選基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)只有兩個(gè)基因（IBSP 和 CD24）具有顯著的預(yù)后價(jià)值（圖 D）。IBSP 基因編碼骨唾液蛋白，該蛋白參與細(xì)胞粘附和遷移，可能與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，IBSP 被認(rèn)為是參與轉(zhuǎn)移的 C6 亞組中的關(guān)鍵基因。在查閱 PROMO 數(shù)據(jù)庫(kù)后，發(fā)現(xiàn) ETS2 可能是調(diào)節(jié) IBSP 的轉(zhuǎn)錄因子，相關(guān)性分析表明，ETS2 對(duì) IBSP 具有調(diào)節(jié)作用，因此，我們認(rèn)為 ETS2 是調(diào)節(jié) IBSP 的潛在轉(zhuǎn)錄因子。

4. 驗(yàn)證 ETS2 通過(guò) IBSP 在體外和體內(nèi)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移
為了研究 IBSP 對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響，首先使用 RT-qPCR 檢測(cè)比較了骨肉瘤細(xì)胞系 （143B， Saos2） 和正常成骨細(xì)胞 （hFOB1.19） 之間 IBSP 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與 hFOB1.19 相比，IBSP 在 Saos2 和 143B 中的表達(dá)更高（圖 1）。隨后，我們?cè)诠侨饬黾?xì)胞系中進(jìn)行了 IBSP 和 ETS2 的沉默和過(guò)表達(dá)功能實(shí)驗(yàn)。在第一步中，我們?cè)O(shè)計(jì)了靶向 IBSP 的 siRNAs 過(guò)表達(dá)慢病毒載體，并在 Saos2 和 143B 細(xì)胞中進(jìn)行了初步轉(zhuǎn)染。結(jié)果表明，si-IBSP 01 表現(xiàn)出最佳的敲低效率（圖 D）。4B 和 C），過(guò)表達(dá)慢病毒載體具有顯著的過(guò)表達(dá)效率（圖 4D 和 E）。因此，si-IBSP 01 和 IBSP 的過(guò)表達(dá)慢病毒載體被用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。Transwell 遷移和侵襲試驗(yàn)顯示，IBSP 敲低顯著降低了 Saos2 和 143Bcells 的遷移和侵襲能力（圖 D）。4F 和 G）。相反，過(guò)表達(dá) IBSP 顯著增加了這兩個(gè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖 D）。4H 和 I）。隨后，我們進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，證實(shí)了 IBSP 在骨肉瘤組織中的表達(dá)（圖 D）。KaplanMeier 曲線顯示，IBSP 的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān) （p < 0.05） （圖 4K），進(jìn)一步支持 IBSP 參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。此外，與對(duì)照組相比，EdU 染色顯示 siRNA 細(xì)胞中的細(xì)胞增殖和 EdU 摻入顯著降低。
 

5. MLN 的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征
對(duì) 2 個(gè)轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)樣本進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制、降維和聚類，將患者 09 的斑點(diǎn)分為 5 個(gè)亞組。反卷積算法確定亞組 0 和 1 是 T 細(xì)胞，亞組 4 是 CAFs，亞組 4 是髓系細(xì)胞（附加文件 9：圖 S5A 和 B）。亞組 2 與 AddModuleScore 算法一起被鑒定為 OB 細(xì)胞（附加文件 9：圖 S5C）。在空間分布方面，OB 細(xì)胞位于 CAFs 和髓系細(xì)胞附近，這進(jìn)一步證實(shí)了 OB 細(xì)胞與這兩種細(xì)胞類型之間的相互作用。有趣的是，CAFs 充當(dāng)屏障，分離 T 細(xì)胞，從而抑制 T 細(xì)胞對(duì) OB 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用（圖 9A）。此外，IBSP 在 OB 細(xì)胞中高表達(dá)，這再次證實(shí)了 IBSP 高表達(dá)可能導(dǎo)致 LN 轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)（圖 9B 和 C）。對(duì)于患者 11，斑點(diǎn)分為 5 個(gè)亞組。亞組 0 和 2 被鑒定為 OB 細(xì)胞，亞組 1 為 CAF，亞組 3 為內(nèi)皮細(xì)胞（附加文件 9：圖 S5D-F）。盡管患者 11 的 MLN 中沒(méi)有 T 細(xì)胞和髓樣細(xì)胞，但仍在 OB 附近觀察到 CAFs，進(jìn)一步證實(shí)了 CAFs 對(duì) OB 的交互影響。此外，內(nèi)皮細(xì)胞散布在 CAFs 和 OB 內(nèi)，為腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)支持（圖 9D）。

結(jié)論
骨肉瘤是一種高度惡性的腫瘤，預(yù)后不良，當(dāng) LN 轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)，患者的生存率會(huì)較低。大多數(shù)研究都集中在骨肉瘤的血行轉(zhuǎn)移上，但很少有關(guān)于 LN 轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制的研究。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞重塑 LN 微環(huán)境的研究幾乎存在空白。因此，我們首次在單細(xì)胞水平上精確剖析了骨肉瘤中 LN 轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。我們鑒定了 OS 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)亞群，并通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 ETS2/IBSP 信號(hào)軸在 LN 轉(zhuǎn)移中的調(diào)節(jié)作用。此外，通過(guò)結(jié)合 scRNA 測(cè)序和相應(yīng)的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) OS 細(xì)胞通過(guò)與骨髓細(xì)胞（主要是巨噬細(xì)胞）和 CAF 相互作用來(lái)提高適應(yīng)性，此外還發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了新的信號(hào)軸 ETS2/IBSP 在骨肉瘤 LN 轉(zhuǎn)移中的作用。

參考文獻(xiàn)：
Liu Y, He M, Tang H, Xie T, Lin Y, Liu S, Liang J, Li F, Luo K, Yang M, Teng H, Luo X, He J, Liao S, Huang Q, Feng W, Zhan X, Wei Q. Single-cell and spatial transcriptomics reveal metastasis mechanism and microenvironment remodeling of lymph node in osteosarcoma. BMC Med. 2024 May 17;22(1):200. doi: 10.1186/s12916-024-03319-w. PMID: 38755647; PMCID: PMC11100118.