RNAi的機理與應用
RNAi 技術的機理與應用
關于 RNAi 技術
RNA 干擾（RNA interference,RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA( double-stranded RNA，dsRNA) 誘發(fā)的、同源 mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象。
RNAi 受到追捧的原因主要有兩個方面，一方面， RNAi 可以說是基因功能檢驗的試金石，利用 RNAi 技術可以縮短人類對人類基因功能的了解和認識的時間，在不久的將來有望將人類大部分基因的功能和作用全部弄清楚；另一方面，科研人員有望利用這種技術獲得使致病基因失活的新型基因藥物，而基因藥物一直是生物技術界追捧的對象。
2002年，《自然》及《科學》兩本重量級學術期刊把 RNA干擾技術視為生命科學領域重大突破，認為足以比肩 20 世紀早期發(fā)現(xiàn)抗生素，開啟了基因治療的另一個方向。
2006年10月，2006年度諾貝爾醫(yī)學獎被授予美國斯坦福醫(yī)學院病理學和遺傳學教授安德魯·菲爾和馬薩諸塞州醫(yī)學院分子醫(yī)學教授克雷格·梅洛，表彰他們發(fā)現(xiàn) RNAi機理。
RNAi迄今已對制藥業(yè)和生物技術工業(yè)產(chǎn)生巨大影響。這也是諾貝爾獎評審委員會為什么不堅持研究成果要經(jīng)過數(shù)十年實踐驗證的“慣例”，破格為菲爾和梅洛頒獎的原因之一。
目前，RNA干擾治療技術正在快速進入人體試驗階段，已有多個 siRNA 藥物進入臨床試驗，其中第一個RNAi藥物 Bevasiranib（美國 Acuity Pharmaceuticals 公司）已處于Ⅲ期臨床試驗階段，有望于 2009 年獲準上市。
RNAi 機理
遺傳物質(zhì) ，化學名稱是“脫氧核糖核酸”，簡稱 DNA 。 DNA 包含約二萬多個蛋白質(zhì)的密碼。當細胞決定要制造某一個蛋白質(zhì)之時，屬于該蛋白質(zhì)的 DNA 密碼便會被“影印”（專業(yè)上稱為轉(zhuǎn)錄 Transcription ），做成一份核糖核酸的“副本” RNA ，又叫 mRNA 。 mRNA 副本會去細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)“工廠”（核糖體〔 Ribosome 〕），然后，按次序?qū)⒍N胺基酸組合成一個蛋白質(zhì)�！�
一些病毒覷準上述機制，把病毒的 RNA 送入細胞，借其核糖體，生產(chǎn)自己的蛋白質(zhì)。這些以 RNA 儲存遺傳訊息的病毒，進入細胞后，會用一個自備的酶把 RNA 制造一個 DNA 的副本，以便可以銜接細胞“ DNA - mRNA - 蛋白質(zhì)”的生產(chǎn)程序。對此，細胞也有對策。方法是用一個叫 Dicer 的酶，把入侵病毒的 RNA 切成很多小段；之后，這些小段 RNA 會很自然地、自動黏在它的 mRNA 上，干擾核糖體制造病毒的蛋白質(zhì)。這便是一個細胞保護自己的機制，稱為 RNA 干擾（ RNA Interference － RNAi ）。
RNAi 是 真核生物 中一種普遍存在且非常保守的機制 , 是一個天然的抗病毒機制。 RNAi 的作用機制可簡述為“雙鏈 RNA 降解 mRNA 從而阻斷特定蛋白質(zhì)的合成”，具體過程如下圖：
首先，外源的或體內(nèi)產(chǎn)生的長雙鏈 RNA(long double stranded RNA, dsRNA) 首先被 Dicer 酶降解為長 21 ～ 23bp （堿基對）長度的小分子雙鏈 RNA （稱為小干擾核酸， small interfering RNA, siRNA), 這是一個依賴 ATP 的耗能過程。切割后的 siRNA 具有 3' 兩個核苷酸 TT 突出末端。
然后， siRNA 結合到核糖核酸酶復合物上形成 RNA 誘導的基因沉默復合體（ RISC ， RNA-induced silencing complex ）。該復合體依賴 ATP 釋能而解聚 siRNA 雙鏈成單鏈以激活 RISC 。活化的 RISC 通過由 siRNA 決定的堿基互補配對原理切割具有同源序列的基因轉(zhuǎn)錄體，最終導致基因沉默效應。
然后， siRNA 結合到核糖核酸酶復合物上形成 RNA 誘導的基因沉默復合體（ RISC ， RNA-induced silencing complex ）。該復合體依賴 ATP 釋能而解聚 siRNA 雙鏈成單鏈以激活 RISC 。活化的 RISC 通過由 siRNA 決定的堿基互補配對原理切割具有同源序列的基因轉(zhuǎn)錄體，最終導致基因沉默效應。
同時， RNAi 過程中又有新的 dsRNA 分子合成 , 當 siRNA 反義鏈識別并結合靶 mRNA 后 , siRNA 反義鏈可作為引物 , 以靶 mRNA 為模板，在依賴于 RNA 的 RNA 聚合酶 (RNA2dependent RNA polymerase , RdRP) 催化下合成新的 dsRNA , 然后由 Dicer 切割產(chǎn)生新的 siRNA , 新 siRNA 再去識別新一組 mRNA, 又產(chǎn)生新的 siRNA, 經(jīng)過若干次合成切割循環(huán) , 沉默信號就會不斷放大。正是這種稱為靶序列指導的擴增 (target2directed amplification) 機制賦予了 RNAi 的高效性和持久性。
siRNA 作為 RNAi 的中介分子，是一種具有 3' 兩個核苷酸 TT 突出末端的 21 ～ 23bp 大小的雙鏈核糖核酸，通過序列互補配對法則特異性降解目的基因。
RNAi 應用
RNAi 作為一種快速、有效、特異的抑制基因表達的工具， RNAi 的應用主要集中在兩個方面：基因功能的研究、核酸干擾（RNAi）治療。
• 基因功能研究
二十世紀最偉大的生物工程 --- 人體基因組工程，在美國主導和全球共同合作下，歷經(jīng) 15 年，耗資 300 億美元，于 2000 年成功地將人體基因組的 30 億個基因密碼解析出來。雖然對總數(shù)約 3 萬的人體基因的結構己清楚，但對于各種基因產(chǎn)物的功能如何？怎么在人體中發(fā)揮作用？哪些和疾病關聯(lián)以及如何用于治療疾病等諸如此類的問題還是束手無策。
與此同時，用基因工程學的方法修正或替換缺陷基因的基因療法已成為基礎和臨床醫(yī)學研究的熱門課題。而實施基因療法的前提是了解疾病相關基因 , 并用特定技術，如基因敲除 (gene knock-out) 驗證其功能。
借助 RNAi 技術，研究者們可對目標基因進行特異性地表達沉默，通過觀察其表達被抑制后細胞以至生物體從形態(tài)到各項生理生化的變化，對該基因的功能及參與的信號網(wǎng)絡進行研究。與其他方法相比， RNAi 技術在基因功能研究上有其獨特的優(yōu)點 : ①簡單易行 , 容易開展； ②與基因敲除相比，實驗周期短、成本低；③與反義技術相比，具有高度特異性和高效性； ④可進行高通量 (high throughout) 基因功能分析。
• RNAi治療
由于 RNAi 是針對轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默，相對于傳統(tǒng)基因治療對基因水平上的敲除，整個流程設計更簡便，且作用迅速，效果明顯，為基因治療開辟了新的途徑。其總體思路是通過加強關鍵基因的 RNAi 機制，控制疾病中出現(xiàn)異常的蛋白合成進程或外源致病核酸的復制及表達。
因此，尋找能導致特定基因沉默的 siRNA ，即可以此開發(fā)出特異性的高效 siRNA 藥物。目前，多數(shù)藥物的作用靶點為蛋白質(zhì) , 要研制這類藥物必須對蛋白質(zhì)的功能和結構有深入了解 , 而研制以 mRNA 為靶點的 RNAi 療法則不會受制于蛋白質(zhì)結構研究的進展。
RNAi 專業(yè)術語
核酸干擾 （RNA interference, RNAi）
核酸干擾是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA ( double-stranded RNA ， dsRNA) 誘發(fā)的、同源 mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象。 RNAi 一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，迅速成為生物學研究領域最為活躍的熱點之一，《 Science 》在 2001 年將其列為十大科學成就之一， 2002 年又將其列為十大科技之首； 《 Nature 》也將 siRNA 評為 2002 年度最重要的科技發(fā)現(xiàn)之一； 2006 年發(fā)現(xiàn) RNAi 機理的兩位美國科學家法爾和梅洛獲得諾貝爾醫(yī)學獎。
RNAi 技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，是一種快速、有效、特異的抑制基因表達的工具，已被廣泛 用于探索基因功能、病毒性疾病（主要是艾滋病和肝炎）及惡性腫瘤的基因治療領域。一方面， RNAi 是基因功能檢驗的試金石，利用 RNAi 技術可以大幅度縮短人類對人類基因功能與作用的了解和認識的時間；另一方面，可以利用 RNAi 技術獲得使致病基因失活的新型基因藥物，即 siRNA 藥物。
小干擾核酸（siRNA）
小干擾核酸（英文縮寫：siRNA ；中文簡稱：小核酸）是帶有特定基因密碼的雙鏈短小核酸，一般長度為 21-23bp （堿基對）。 通俗地講，一個基因通常含有有數(shù)千個 bp ， siRNA 是其中長度為 21 ～ 23bp 的某一段特異序列。
siRNA 可以克隆到 siRNA 表達載體，其功能是在哺乳動物細胞內(nèi)和特定靶基因的信使核糖核酸（ mRNA ）結合，使之降解，失去靶基因表達而“沉默”下來，即“關閉”該基因的功能。這種 siRNA 降解 mRNA 從而阻斷特定蛋白質(zhì)合成的機制即為核酸干擾（ RNAi ）。
標簽：
RNAi siRNA 核酸干擾
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