小鼠脾臟T細胞和人PBMCs的體外T細胞活化實驗詳解
導(dǎo)言
成熟T細胞通過TCR識別并與抗原-MHC復(fù)合物反應(yīng)。TCR活化的最直接后果是信號通路的起始，這些信號通路包括誘導(dǎo)特異性蛋白酪氨酸激酶（PTKs）、PIP2分解、PKC活化以及細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。這些早期事件被傳遞到核，產(chǎn)生諸多效應(yīng)：
1、 T細胞克隆的擴增
2、 細胞表面活化標(biāo)志的上調(diào)
3、 分化成效應(yīng)性細胞
4、 誘導(dǎo)細胞毒或細胞因子的分泌
5、 誘導(dǎo)凋亡
最常用的體外刺激檢測 T細胞增殖的方法是用 TCR的抗原或競爭性抗體活化 T細胞。
本 protocol 是一個基本方法，用 CD3 體外刺激小鼠脾 T 細胞和人類外周血 T細胞的增殖，關(guān)鍵參數(shù)包括細胞密度、抗體滴度和活化動力學(xué)。
一、 小鼠：
用包被的 145-2C11單抗刺激小鼠T細胞；MTT法測細胞增殖
材料
1X 無菌 PBS
Anti-mouse CD3e, Clone 145-2C11 (Functional Grade, eBioscience Cat. No. 16-0031, or Purified,eBioscience Cat. No. 14-0031)
RPMI-1640 完全培養(yǎng)基
無菌的小鼠脾臟或淋巴結(jié)單細胞懸液
96 孔平底帶蓋微孔板
MTT Buffer
MTT裂解液
刀豆蛋白 A，可選 (ConA, Sigma Cat. No. C5275)
儀器用具
微量移液器或排槍
離心機
37°C, CO2培養(yǎng)箱
96孔板讀板機
實驗時間
2小時包被抗體
20分鐘制備脾臟單細胞懸液
20分鐘分析設(shè)置
2-4天孵育
實驗步驟
抗體包被至微孔板：
1、 用無菌 PBS 制備 5-10µg/ml 的 anti-CD3e (145-2C11)抗體溶液，計算所需的抗體量，每個條件或樣品做復(fù)孔。例如，包被半張板需要 2.6ml 抗體溶液。若用其他抗體共刺激時，CD3 抗體的濃度可以降低。
2、 每孔加入 50μl 抗體，空白對照孔加 50μl 無菌 PBS。
3、 用ParafilmTM膜將板封好，37℃孵育 2 小時或 4℃過夜。
4、 加細胞之前，將孔內(nèi)的抗體溶液吸去。
5、 每孔用 200μl 無菌 PBS 洗后，棄去 PBS。
6、 重復(fù)洗一次，去除所有的未結(jié)合抗體。
加細胞：
1、 取脾臟，無菌制備單細胞懸液。溶血去除紅細胞。
2、 計數(shù)細胞并重懸于RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中，濃度為 106/ml。根據(jù)實驗需要可選擇 2-3x106/ml～105/ml的濃度。
3、 洗板結(jié)束后，每孔加 200μl 細胞懸液，置于潮濕的 37°C, 5% CO2 培養(yǎng)箱中�？蛇x擇加刺激對照：ConA 1-4µg/ml 刺激后孵育。
4、 孵育 2-4 天。可根據(jù)具體的實驗進行優(yōu)化。
5、 每孔加 20μl MTT buffer 再放回至培養(yǎng)箱中孵育 4 小時。
6、 每孔加 50μl MTT 裂解液，輕輕振蕩并孵育過夜。
7、 第二天 570nm 讀板。
8、 計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差，作圖。
二、 人：
用 CD3 單抗刺激人外周血單個核細胞（PBMCs）；MTT 法檢測細胞增殖。
材料
1X 無菌 PBS
Anti-human CD3:
Clone OKT3 (Functional Grade， eBioscience Cat. No. 16-0037) or Clone HIT3a (Functional Grade， eBioscience Cat. No. 16-0039)
RPMI-1640 完全培養(yǎng)基
無菌 PBMC
96孔平底帶蓋微孔板
MTT Buffer
MTT 裂解液
儀器用具
微量移液器或排槍
離心機
37°C, CO2 培養(yǎng)箱
96 孔板讀板機
實驗時間
30 分鐘制備 PBMCs
20 分鐘設(shè)置分析
2-4 天孵育
實驗步驟
1、 制備PBMCs并重懸于RPMI完全培養(yǎng)基中，濃度 1-2x106/ml�？筛鶕�(jù)實驗調(diào)整細胞濃度至 2-3x106/ml～105/ml。
2、 每孔加 100μl 細胞懸液，每種樣品做復(fù)孔。
3、 每孔加 100μl 可溶性抗體，優(yōu)化抗體濃度。若使用分離的 T 細胞做增殖分析，推薦用 10μg/ml 抗體包被在 96 孔板上進行刺激。
4、 放置于潮濕的 37°C, 5% CO2 培養(yǎng)箱中。
5、 孵育 2-4 天�？筛鶕�(jù)具體的實驗進行優(yōu)化。
6、 每孔加 20μl MTT buffer 再放回至培養(yǎng)箱中孵育 4 小時。
7、 每孔加 50μl MTT 裂解液，輕輕振蕩并孵育過夜。
8、 第二天 570nm 讀板。
9、 計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差，作圖。
緩沖液和培養(yǎng)基
RPMI-1640 完全培養(yǎng)基：
900ml RPMI-1640
熱滅活的 100ml FBS（10%終濃度）
1ml 2-巰基乙醇
10ml L-谷氨酸鹽
抗生素混合物（可選）
MTT Buffer：
MTT 貯存液：溶于 1X PBS，濃度為 5mg/ml，避光保存
MTT 裂解液：
20% SDS 50% DMF
相關(guān)產(chǎn)品
|
廠商 |
目錄號 |
產(chǎn)品名稱(簡述) |
規(guī)格 |
目錄價 |
|
Liankebio |
LK-MTT001 |
MTT Cell Proliferation Assay Kit |
100assays |
150 |
|
LK-MTT002 |
MTT Cell Proliferation Assay Kit |
200assays |
200 | |
|
LK-MTT005 |
MTT Cell Proliferation Assay Kit |
500assays |
300 | |
|
LK-MTT010 |
MTT Cell Proliferation Assay Kit |
1000assays |
500 | |
|
LK-CCK801 |
Cell Counting Kit-8(CCK-8細胞增殖檢測試劑盒) |
100T |
200 | |
|
LK-CCK802 |
Cell Counting Kit-8(CCK-8細胞增殖檢測試劑盒) |
200T |
360 | |
|
LK-CCK805 |
Cell Counting Kit-8(CCK-8細胞增殖檢測試劑盒) |
500T |
600 | |
|
LK-CS0006 |
Lipopolysaccharides(LPS)脂多糖 |
0.5mg |
90 | |
|
LK-CS0005 |
CONCANAVALIN A(Con A)刀豆素A |
1mg |
90 | |
|
eBioscience |
85-16-0037-85 |
Functional Grade Purified anti-human |
500 ug |
3,840 |
|
CD3 | ||||
|
85-16-0039-81 |
Functional Grade Purified anti-human |
50 ug |
1,320 | |
|
CD3 | ||||
|
85-16-0039-85 |
Functional Grade Purified anti-human |
500 ug |
3,840 | |
|
CD3 | ||||
|
85-16-0031-81 |
Functional Grade Purified Hamster |
50 ug |
780 | |
|
anti-mouse CD3 (epsilon subunit; CD3e) | ||||
|
85-16-0031-82 |
Functional Grade Purified Hamster |
100 ug |
1,440 | |
|
anti-mouse CD3 (epsilon subunit; CD3e) |
