新冠狀病毒SARS-COV-2的快速檢測及側(cè)向流技術(shù)的應(yīng)用

 
起初，這只是一次發(fā)燒，一個(gè)噴嚏，一聲咳嗽，只是一場看似簡單的感冒，直到它將上千的生命奪去，直到它把每個(gè)人「困」住，我們才意識(shí)到要將它擊敗需要我們團(tuán)結(jié)齊心，需要技術(shù)快速響應(yīng)，需要從檢出到治療到預(yù)防的全面結(jié)合。
   
首先，讓我們來認(rèn)識(shí)這個(gè)罪魁禍?zhǔn)住?/strong>
SARS-COV-2 是一種 RNA 病毒，屬于冠狀病毒β屬，有包膜，呈橢圓形，直徑為 60-140 nm。
國家科技部發(fā)布《新冠狀病毒（2019-nCOV）現(xiàn)場快速檢測產(chǎn)品研發(fā)應(yīng)急項(xiàng)目申報(bào)指南》拉開了新冠現(xiàn)場快檢的帷幕，指南一共提及了三種類型的產(chǎn)品：核酸快速檢測設(shè)備及試劑，抗原快速檢測試劑和抗體快速檢測試劑。其中兩種是免疫學(xué)病毒快速檢測。
 
其中免疫學(xué)病毒檢測方法主要有兩種：
◆ 第一種是通過抗體測抗原，抗體表位的選擇上以 S，N 蛋白為主。
◆ 另一種是通過病毒抗原的固相化來檢測病毒抗體，抗原可以通過全病毒裂解液或者靶點(diǎn)蛋白重組表達(dá)獲得。
 
通常來說，IgM 抗體在感染早期出現(xiàn)，IgG /IgM 抗體在感染中晚期出現(xiàn)，并在血液循環(huán)中保持較長時(shí)間存在，但抗體檢測容易受到血液標(biāo)準(zhǔn)中的一些物質(zhì)感染并且不同人對于病毒的免疫應(yīng)答也存在差異，所以抗體檢測必須采用 IgM 和 IgG 同時(shí)檢測且通常需多次動(dòng)態(tài)檢測來確認(rèn)。
 
從側(cè)向流層析產(chǎn)品角度來看，找到合適的抗體或者重組抗原產(chǎn)品是產(chǎn)品開發(fā)的第一步，除了需要考慮檢測抗體的靈敏度和特異性外，還需要考慮標(biāo)志物的選擇，另外試紙條的工藝也對 IgG/IgM 的檢查有很大的影響。
 
通常側(cè)向流層析試紙條主要包括四個(gè)部分，樣本墊，結(jié)合物釋放墊，NC 膜和吸收墊。
Whatman（沃特曼）作為具有將近 300 年歷史的體外診斷專業(yè)耗材供應(yīng)商，可以提供這四個(gè)組件的全方位高品質(zhì)材料，從玻纖到棉纖，再到種類最為齊全的 NC 膜，如下圖示意，這里列出了部分 Whatman 推薦的適用產(chǎn)品，如有更詳細(xì)的需求可以聯(lián)系我們的區(qū)域銷售代表或技術(shù)支持。

 

Fig.1 側(cè)向流層析產(chǎn)品及相關(guān)推薦

 
在新版的 COVID-19 診療方案中，核酸檢測依然是患者臨床確診和康復(fù)出院的重要依據(jù)，也是接觸者解除隔離的重要判斷依據(jù)。
 
我們知道 SARS-COV-2 是一種 RNA 病毒，它的遺傳物質(zhì)是核糖核酸，其特異性核酸序列是區(qū)分這一病毒與其他病原體的標(biāo)志物。新冠狀病毒核酸檢測的目的就是為了在感染患者體內(nèi)找到該病毒的存在。
 
目前普遍采用的是核酸檢測方法即第二代實(shí)時(shí)多重?zé)晒舛��?RT-PCR 技術(shù)，主要步驟包括樣本采集，核酸提取、目標(biāo)片段、擴(kuò)增、檢測等。
 

 

Fig.2 多重?zé)晒舛��?RT-PCR 技術(shù)流程圖

 
其中 mRNA 的提取試劑盒主要包括硅膠膜柱式法和磁珠法，與硅膠柱吸附法相比，磁珠法自動(dòng)化程度高，適用于大批量樣本的處理。但硅膠柱吸附法提取 RNA 的效率相對較高，適用于微量病毒 RNA 提取。
 
目前，以 Whatman 高質(zhì)量玻纖為原料制備的柱式核酸提取試劑盒已經(jīng)在一線發(fā)揮著重要的作用�？捎糜谥�式核酸提取柱的高純度玻纖和石英產(chǎn)品包括：

Table.1 用于核酸提取試劑柱玻纖產(chǎn)品性能表

核酸檢測雖然是患者臨床確診和康復(fù)出院的重要依據(jù)，但由于耗時(shí)長，一定程度上減慢疾病檢測的速度，免疫側(cè)向流雖然測試時(shí)間短但靈敏度相較于核酸檢測尚比較低且 IgG/IgM 檢測有一定的窗口期。
 
是否有方法能夠?qū)⒑怂釞z測的優(yōu)勢和側(cè)向流的優(yōu)勢相結(jié)合呢？
 
近日，MIT 的 Zhang Feng 團(tuán)隊(duì)提出了使用高靈敏度酶促解鎖（SHERLOCK）技術(shù)，檢測 COVID-19 的方案。
 
使用合成的 SARS-COV-2 病毒 RNA 片段，能夠在 20 到 200 aM 之間一致的檢測 COVID-19 靶序列。從用于 qRT-PCR 測試的核酸提取開始，在 1 個(gè)小時(shí)內(nèi)完成所有的步驟：

Fig.3 SHERLOCK 技術(shù)檢測 SARS-COV-2 流程示意圖


Fig.4 不同濃度樣本檢測示意圖

 
SHERLOCK 技術(shù)最早是在 2018 年由 Zhang Feng 及其團(tuán)隊(duì)提出，并在 2018 年和 2019 年相繼發(fā)表了論文詳細(xì)闡述了該項(xiàng)技術(shù)的理論及應(yīng)用，此技術(shù)也給我們提供了很好的檢測思路，也希望能從科研早日進(jìn)入到臨床應(yīng)用。
 
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參考文獻(xiàn)
SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Kellner MJ. Koob JG.  Gootenberg JS, Abudayyeh OO, and Zhang F. Nuture Protocols. 2019 Oct; 14 (10):2986-3012, doi: 10.1038/s41596-019-0210-2