技術(shù)干貨 | 四血管阻塞全缺血模型的制作
四血管阻塞全腦缺血模型
缺血性腦損傷是目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病研究的熱點(diǎn)，建立穩(wěn)定和易操作的動(dòng)物模型是缺血性血管病研究的基礎(chǔ)。目前研究最多的是 Pulsinelli大鼠全腦缺血四血管模型，是最經(jīng)典的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭唬陙肀辉S多學(xué)者所使用。此方法能夠有效地模擬臨床中出現(xiàn)的因低血壓休克及心肺腦復(fù)蘇而導(dǎo)致的大腦缺血性損傷，且該模型具有較好可重復(fù)性，因此大批量用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。
1.動(dòng)物選擇
- 大鼠
對(duì)于四血管阻塞模型，比較理想的動(dòng)物為 Wistar大鼠。品系好壞、是否為同一供應(yīng)商和動(dòng)物的周齡是影響實(shí)驗(yàn)成功率的幾個(gè)重要因素。體重在250~300g的年輕大鼠成功率較高，而且四血管阻塞模型穩(wěn)定性更好。由下表可知，一般選擇Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
- 小鼠
小鼠體型小，椎動(dòng)脈分離阻塞困難，因此常采用蒙古沙土鼠。沙土鼠也是最早用于全腦缺血研究的動(dòng)物。沙土鼠的優(yōu)點(diǎn)是天生缺少兩條后交通動(dòng)脈，因此后循環(huán)不會(huì)代償前循環(huán)，只需結(jié)扎兩側(cè)頸總動(dòng)脈即可實(shí)現(xiàn)全腦缺血。但是，因?yàn)閃illis環(huán)存在變異，只有30%-40%的小鼠能成功實(shí)現(xiàn)全腦缺血，而75%的沙土鼠在結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈后就會(huì)造成心臟驟停。但沙土鼠比較難購買到。
2.手術(shù)操作步驟
基本的四血管阻塞模型
用異氟醚麻醉后，使大鼠平躺在手術(shù)臺(tái)上，用呼吸麻醉維持動(dòng)物的麻醉狀態(tài)。
- 頸動(dòng)脈周圍放置阻塞設(shè)備
(1)頸部腹側(cè)正中劃開一傷口，使其皮膚分開。
(2)雙手操作小彎鑷將覆蓋在頸部腹側(cè)的肌肉及其他組織分開，暴露實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的頸總動(dòng)脈。
(3)將迷走神經(jīng)和頸交感神經(jīng)鏈輕輕撥開，分離出頸總動(dòng)脈，操作期間防止破壞神經(jīng)。
(4)將阻斷裝置一根硅管(外徑15mm，內(nèi)徑8mm，長10~15cm)分別松散地扣在頸總動(dòng)脈上，并穿過紐扣的兩個(gè)小洞。
(5)硅膠管兩次穿過塑料管兩端，將管子打結(jié)，系緊形成一個(gè)環(huán)。環(huán)的長度應(yīng)該比塑料管的長度要小，這樣就可以用來做阻塞裝置了。因此，當(dāng)硅管通過塑料管拉緊后，將和按鈕共同阻斷頸動(dòng)脈血流。
(6)用1~2根手術(shù)線縫合傷口。
- 電凝椎動(dòng)脈
(1)將大鼠固定在立體定位架上，從頸背枕骨到第2頸椎(長約1cm)做一切口。剝離椎旁肌肉，暴露第1頸椎的翼孔。目的是充分暴露翼孔，可以在大鼠尾部系一根橡皮筋適當(dāng)拉長頸椎。
(2)把雙極電凝器鑲嵌進(jìn)入翼孔，永久燒灼椎動(dòng)脈。電凝這一步是缺血成功的關(guān)鍵。如果加熱過久會(huì)損傷下頸椎腦橋，增加死亡率；反之，若時(shí)間過短，不能完全電凝阻斷椎動(dòng)脈，導(dǎo)致缺血不完整。目前，沒有十分完美的方法來檢測椎動(dòng)脈是否永久閉塞。筆者的經(jīng)驗(yàn)是，利用像注射器針頭那樣帶有尖頭的小探頭，插入阿拉爾孔，稍微彎曲，如果出血，則需要再電凝一次。也可以用結(jié)扎的方式阻斷椎動(dòng)脈。
椎動(dòng)脈結(jié)扎
(a)暴露第一頸椎，顯露左側(cè)翼孔(箭頭處)
(b)(c)插入電凝器，凝閉左側(cè)椎動(dòng)脈
(d)顯露右側(cè)翼孔(箭頭處)
(e)(f)插入電凝器，凝閉右側(cè)椎動(dòng)脈
(3)縫合傷口，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入舒適的籠內(nèi)休息
- 雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻塞
(1)第2天繼續(xù)手術(shù)(禁食過夜，同時(shí)血糖水平一致)，首先使其露出腹側(cè)頸部。
(2)去除腹側(cè)頸部的手術(shù)縫線，牽拉塑料管中的硅管，然后系緊硅管，完全阻止頸總動(dòng)脈的血流。
(3)驗(yàn)證缺血成功。如果缺血成功，1min后大鼠將失去翻正反射。在整個(gè)手術(shù)過程中，大鼠體溫由一個(gè)連有直腸溫控探頭的加熱墊維持在37℃。
(4)阻塞一定時(shí)間后，松開系緊的結(jié)并恢復(fù)血流，這里說的一定時(shí)間取決于所要研究的大腦區(qū)域，動(dòng)物將在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血流。
3.四血管阻塞1天模型(記錄缺血去極化狀況)
大腦溫度是影響缺血后細(xì)胞死亡嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素。另一個(gè)潛在的因素是頭部和頸部肌肉產(chǎn)生的側(cè)支血管。這種改進(jìn)后的四血管阻塞模型將腦部溫度維持在37℃，以缺血去極化為是否完全缺血的指標(biāo)。
- 手術(shù)準(zhǔn)備
(1)除在管子打結(jié)處綁手術(shù)縫線外，阻斷頸總動(dòng)脈和電凝椎動(dòng)脈的步驟與前面所述相同。
(2)在頭骨的一側(cè)鉆一個(gè)洞，目的是放入一個(gè)溫控探頭。
(3)將直徑為8mm溫控探頭輕輕地放入頭骨下硬腦膜上，將體溫維持在37℃。
(4)在所需要研究的腦部另一側(cè)再打一個(gè)洞。海馬定位的坐標(biāo)是前囟前(AP)5.0mm，旁開(ML)2.5mm；紋狀體定位的坐標(biāo)是前囟前(AP)9.5mm，旁開(ML)3.0mm(耳間)。
(5)用尖頭鑷子剝掉硬腦膜，通過滴加生理鹽水維持腦部濕潤。
(6)在腹側(cè)頸部的開口處皮膚下放置一個(gè)參比電極(銀線)。
- 缺血去極化
(1)準(zhǔn)備一個(gè)玻璃微電極，并使該尖端為5~10m。用2mol氯化鈉溶液灌注電極。
(2)緩緩將微電極伸到該區(qū)域(海馬DV2.5mm，紋狀體DV3.0mm)。
(3)將記錄電極和參比電極連接到放大器上，調(diào)整直流電源（direct current，DC）電勢到0mV。
(4)基礎(chǔ)測定1~2min，拉線阻塞雙側(cè)頸總，將線結(jié)固定在塑料管的凹痕中，如果缺血成功，0~20 mV的DC電勢將在2~3min后瞬間下降。
(5)研究海馬時(shí)，ID測定10min后應(yīng)放松阻塞的線；研究紋狀體時(shí)，ID需測定20min。1~2min后DC電勢應(yīng)該回復(fù)到0 mV。
(6)移去電極，用手術(shù)夾子閉合傷口。
4.注意事項(xiàng)及常見問題解答
- 注意事項(xiàng)
癲癇是一種腦缺血后常見的并發(fā)癥。缺血損傷程度和持續(xù)時(shí)間與癲癇的發(fā)病率呈正相關(guān)。在Wistar大鼠中，20min缺血可能誘發(fā)20%-30%的大鼠癲癇發(fā)作。癲癇發(fā)作引起的大腦損傷與缺血損傷不同，因此，缺血后癲癇發(fā)作的動(dòng)物必須被找出并剔除實(shí)驗(yàn)。判別癲癇的一種方法是觀察籠子里的墊料是否被動(dòng)物濺到籠子外。手術(shù)并發(fā)癥同樣值得引起注意，包括腦脊液滲漏等，這將導(dǎo)致減壓效應(yīng)以及額外的組織損傷。
全腦缺血對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷很大，同時(shí)模型的成功并不是很好的量化。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物的死亡會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的科學(xué)分組與實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程，所以要求盡量選擇身體狀況相同、年齡相近的大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，同時(shí)要求實(shí)驗(yàn)者規(guī)范模型制作過程，不可出現(xiàn)偏差。
- 常見問題及解決方法
死亡率
大約10%的大鼠在缺血過程中死亡，或者于再灌注后不久死亡，即使是操作者技術(shù)很熟練也會(huì)出現(xiàn)這種情況。2~3min阻塞過程中的呼吸衰竭是造成缺血后動(dòng)物死亡的一個(gè)主要原因。立即復(fù)蘇一般能救活動(dòng)物。再灌注后大鼠的死亡可能源于嚴(yán)重的腦缺血和腦血栓。此外，脖子和頭部的手術(shù)創(chuàng)傷會(huì)增加死亡率。除 Wistar外的其他品系死亡率可能更高。
解決方法
盡管結(jié)果可重復(fù)，不同動(dòng)物的四血管阻塞模型結(jié)果可能不同，即使是成功缺血的動(dòng)物間，兩個(gè)半球腦損傷程度也不盡相同，實(shí)驗(yàn)效果不能完全量化一致。
許多因素影響缺血性結(jié)果，包括腦血管側(cè)支循環(huán)、腦溫、腦葡萄糖水平、麻醉、氧分壓和二氧化碳分壓等。重要的是要嚴(yán)格控制變量和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，有助于獲得穩(wěn)定一致的結(jié)果。
*以上內(nèi)容部分源自《實(shí)驗(yàn)卒中模型方法學(xué)》
書號(hào)：ISBN 978-7-313-21776-9
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