酶促恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（ERA）在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，進(jìn)口貿(mào)易的增多，食品安全檢測(cè)也日趨嚴(yán)格。常用于食品安全檢測(cè)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)，是目前大部分檢測(cè)機(jī)構(gòu)及醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室都在使用的常規(guī)技術(shù)。

然而該技術(shù)需要昂貴且精密的控溫設(shè)備，耗費(fèi)較長時(shí)間，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中不具備優(yōu)勢(shì)，因此，我們需要更加簡(jiǎn)便的技術(shù)來提高檢測(cè)效率。

等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的問世為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)帶來新的曙光。今天給大家介紹下先達(dá)基因的酶促恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (ERA)。

本文對(duì)酶促恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)行綜述。ERA 技術(shù)全稱酶促恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種替代品，也是一種全新的升級(jí)，可準(zhǔn)確、快速、便攜地進(jìn)行核酸檢測(cè)分析。

ERA 與 PCR 擴(kuò)增一樣具有特異性，但速度快得多，結(jié)果通常在 5～ 10 min 生成。而且與 PCR 不同的是，ERA 反應(yīng)不需要熱變性，因此不需要昂貴的熱循環(huán)設(shè)備。ERA對(duì)操作溫度要求并不嚴(yán)格，反應(yīng)在 37～42℃的溫度下工作最優(yōu)，比其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)需要的溫度要低，能在廣泛的環(huán)境溫度下工作。

ERA可以在多種應(yīng)用中取代PCR，如傳染病診斷、食品安全檢測(cè)、水產(chǎn)畜牧疫病檢測(cè)等等，它非常適合于現(xiàn)場(chǎng)、護(hù)理點(diǎn)和其他設(shè)備缺乏的環(huán)境，特別是對(duì)于檢測(cè)速度需求較高的情況下。

 

一、ERA 技術(shù)介紹

1、反應(yīng)原理 

酶促恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（ERA技術(shù)）是先達(dá)基因公司團(tuán)隊(duì)研發(fā)的具有全球自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，將來源于細(xì)菌，病毒和噬菌體的特定工具酶進(jìn)行改造突變并篩選其功能，通過不同的核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化組合，從而獲得核心的酶促恒溫?cái)U(kuò)增體系。

模擬生物體遺傳物質(zhì)自身擴(kuò)增復(fù)制的原理，通過蛋白定向進(jìn)化、DNA與核酶親和力成熟等技術(shù)對(duì)重組酶、核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶等多酶體系進(jìn)行改造，建立ERA擴(kuò)增反應(yīng)體系，使之將單分子DNA/RNA的特異性區(qū)段在5-10分鐘內(nèi)擴(kuò)增10^9倍。

 

2、引物設(shè)計(jì) 

ERA 引物設(shè)計(jì)原則：

(1) 引物長度最長是 35 bp，最好為 29～32bp，過短會(huì)影響重組酶活性。

(2) 5’端開頭核苷酸最好是胞嘧啶，能促進(jìn)擴(kuò)增片段的重組，5’端避免出現(xiàn)3 到 5 個(gè)連續(xù)的聚鳥嘌呤。

(3) 3’端最好為胞嘧啶和鳥嘌呤，有助于聚合酶的穩(wěn)定結(jié)合提升引物擴(kuò)增性能。

(4) 引物中避免出現(xiàn)特殊序列，如避免出現(xiàn)回文序列和連續(xù)的重復(fù)結(jié)構(gòu)。

(5) 引物設(shè)計(jì)時(shí)盡量避免容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列，減少引物二聚體的形成。

(6) GC 含量過高(>60%)或過低(<40%)都不利于 ERA 擴(kuò)增。

 

3、技術(shù)特點(diǎn)

ERA 技術(shù)與傳統(tǒng)的 PCR 擴(kuò)增相比在便捷性以及高效性上有顯著的優(yōu)勢(shì)，與 PCR 技術(shù)相比有以下特點(diǎn)：

（1）反應(yīng)能夠在恒溫條件下進(jìn)行。盡管 ERA 的反應(yīng)模式與 PCR 相似，但不同的是 PCR 反應(yīng)需要加熱使 DNA 模板變性，而 ERA 不需要，在 37～42℃的條件下，利用重組酶引物復(fù)合體掃描雙鏈 DNA，促使 DNA 鏈上同源位點(diǎn)的互換。

（2）耗時(shí)短。ERA 反應(yīng)速度快，能在 5～10 min 完成檢測(cè)。在許多情況下，沒有經(jīng)過專門訓(xùn)練的人就可以采集樣本，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并在半小時(shí)內(nèi)得到結(jié)果。檢測(cè)速度遠(yuǎn)勝于其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。

（3）操作簡(jiǎn)單。ERA 擴(kuò)增的基礎(chǔ)體系含有 DNA 擴(kuò)增所需的所有試劑，只需加入引物和模板就可以反應(yīng)，不需要復(fù)雜的樣品前處理，這大大提高了操作效率，避免繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟帶來可能性的誤差。

（4）不受場(chǎng)地的限制。PCR 擴(kuò)增需要專門的 PCR 儀，ERA 技術(shù)由于對(duì)溫度要求低，甚至可以用人體溫度進(jìn)行，并可以在條件較為簡(jiǎn)陋的地方進(jìn)行檢測(cè)。

（5）高靈敏性。在復(fù)雜樣品中，ERA 技術(shù)可以檢測(cè)單拷貝的 DNA 和幾十個(gè)或更少拷貝數(shù)的 RNA 分子，而不需要事先進(jìn)行核酸純化和富集。

 

4、操作過程 

含有重組酶及聚合酶干粉的反應(yīng)管中分別加入反應(yīng)緩沖液、上下游引物以及模板 DNA，用純水補(bǔ)至總體積，充分混勻，加入激活劑，上下顛倒 8～10 次混合均勻，瞬時(shí)離心后，可上機(jī)反應(yīng)。

 

二、ERA 及衍生技術(shù) 

1、基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增ERA法

基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增ERA法是一種快速、靈敏的檢測(cè)方法。該技術(shù)不需要復(fù)雜的樣品前處理環(huán)節(jié)，常溫下就能夠?qū)�樣品中的目�?biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，簡(jiǎn)化了過程分析，在 15～20 min 的反應(yīng)時(shí)長內(nèi)能完成實(shí)驗(yàn)要求，遠(yuǎn)低于其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的時(shí)長要求。它既不需要 PCR 所依賴的熱循環(huán)儀器,也不像環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)需要提前準(zhǔn)備預(yù)變性的模板。

基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增ERA法具有快速、靈敏、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是 ERA 系列技術(shù)的基礎(chǔ)，最后的產(chǎn)物可用瓊脂糖凝膠電泳等終點(diǎn)法進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)。

 

2、實(shí)時(shí)熒光型核酸擴(kuò)增ERA法

實(shí)時(shí)熒光型核酸擴(kuò)增ERA，是 ERA 基礎(chǔ)反應(yīng)體系與熒光探針結(jié)合起來的一種聯(lián)用技術(shù)。與熒光 PCR 比較，兩者具有相同的靈敏度與特異性，然而實(shí)時(shí)熒光ERA 的檢測(cè)過程所需時(shí)間明顯短于實(shí)時(shí)熒光 PCR，即實(shí)時(shí)熒光ERA法所需時(shí)間是 10～15 min，實(shí)時(shí)熒光PCR 則需耗時(shí)約 90 min，且PCR 的實(shí)驗(yàn)操作設(shè)備較復(fù)雜、昂貴，而且所占空間大、不便攜帶。

此外，實(shí)時(shí)熒光 PCR 不僅需要一個(gè)熱循環(huán)過程而且實(shí)驗(yàn)操作步驟復(fù)雜，而實(shí)時(shí)熒光ERA法實(shí)驗(yàn)操作溫度在 37～42 ℃ 的恒溫條件下就可進(jìn)行，不需復(fù)雜的操作程序。用雙標(biāo)記寡核苷酸探針檢測(cè)目標(biāo)擴(kuò)增，該探針的 5’末端含有熒光基團(tuán) （Tamra 或 FAM)，3’末端含有淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針與被擴(kuò)增的靶 DNA 結(jié)合時(shí)，外切酶切割基本位點(diǎn)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)被分離，從而產(chǎn)生出與擴(kuò)增目標(biāo) DNA 數(shù)量成正比的熒光信號(hào)，熒光強(qiáng)度也會(huì)隨著其擴(kuò)增而增強(qiáng)。熒光強(qiáng)度信號(hào)實(shí)時(shí)檢測(cè)由熒光信號(hào)檢測(cè)器或掃描儀完成，該試劑可配合先達(dá)基因生產(chǎn)的熒光恒溫?cái)U(kuò)增儀GS8使用，實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增與熒光信號(hào)檢測(cè)于一體。

該技術(shù)敏感性強(qiáng)、特異性高，檢測(cè)時(shí)間短，已有不少用戶利用該技術(shù)建立呼吸道病原快速檢測(cè)的方法。

 

3、 試紙型核酸擴(kuò)增ERA法

ERA技術(shù)與試紙條側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)相結(jié)合，建立一種快速靈敏的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)系統(tǒng)。實(shí)現(xiàn)了利用側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l作為終點(diǎn)法對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行快速檢測(cè)。該方法中引物用生物素進(jìn)行了標(biāo)記和探針用FAM 或FITC進(jìn)行了標(biāo)記，擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合到包埋有對(duì)應(yīng)抗體的試紙條上并顯色，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。該方法無需特定檢測(cè)設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，能夠快速直觀獲得檢測(cè)結(jié)果。

試紙型ERA法檢測(cè)結(jié)果能在橫向流動(dòng)試紙條上顯示，裸眼便可觀察，即使是非專業(yè)人員也可以直接分析結(jié)果，非常適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，尤其在經(jīng)濟(jì)條件差資源缺乏的區(qū)域，具有更好的應(yīng)用前景。

 

4、酶促擴(kuò)增酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ERA-ELISA) 

酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay)是抗原抗體的特異性反應(yīng)，指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上，進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量方法。

ERA-ELISA 技術(shù)是在 ERA 技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合 ELISA 技術(shù)發(fā)展起來的用于檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的新型分析檢測(cè)手段，綜合了 ERA、ELISA 兩種技術(shù)的特點(diǎn)，在特異性、靈敏性等方面表現(xiàn)出優(yōu)異的特點(diǎn)、而且操作過程簡(jiǎn)單，結(jié)果不需要電泳檢測(cè)和 ERA 產(chǎn)物純化，較短時(shí)間內(nèi)可以完成整個(gè)檢測(cè)過程。

同時(shí)，能在數(shù)小時(shí)內(nèi)對(duì)大量待檢樣品進(jìn)行篩選和鑒定，適用于資源匱乏的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)是一種有效的聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)。

 

三、ERA 技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用 

目前，ERA技術(shù)在涉及食品安全檢測(cè)方面已有多項(xiàng)產(chǎn)品，并且在快速便捷檢測(cè)等方面優(yōu)于 PCR 檢測(cè)。ERA 技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用主要包括致病微生物、動(dòng)物源性成分及轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)等方面。

1、食源性致病菌的 ERA 檢測(cè) 

沙門氏菌是引起世界各地食源性疾病暴發(fā)的最常見病原，許多流行病學(xué)調(diào)查將沙門氏菌爆發(fā)的源頭歸咎于家禽和家禽副產(chǎn)品，包括蛋類。先達(dá)基因建立了一種快速檢測(cè)沙門氏菌的熒光檢測(cè)方法，在 37～42 ℃下，僅需要 10 min 的擴(kuò)增就能達(dá)到擴(kuò)增子的檢測(cè)閾值。

大量擴(kuò)增后的產(chǎn)物能夠與帶有熒光標(biāo)記的探針相結(jié)合，從而產(chǎn)生特定的熒光。該熒光信號(hào)可由熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲，直觀反映擴(kuò)增循環(huán)情況。樣品中如果具有微量的沙門氏菌DNA存在時(shí)，則能夠通過大量擴(kuò)增后激發(fā)熒光信號(hào)，樣本顯示為陽性；如果樣本中不含有沙門氏菌，儀器會(huì)判讀為陰性。由此可見，ERA技術(shù)能夠?yàn)槭吃葱灾虏【�的檢測(cè)提供一種簡(jiǎn)便的方法。

該方法具有良好的特異性和較高的靈敏度。且不需要昂貴的設(shè)備，可作為野外條件下食物中沙門氏菌的檢測(cè)試劑盒。

同時(shí)，先達(dá)基因還生產(chǎn)有金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、志賀氏菌、李斯特氏菌、霍亂弧菌等一系類食品致病菌檢測(cè)試劑盒。

 

2、肉類摻假檢測(cè) 

肉類食品是人們生活中最重要的生鮮類食品之一，隨著生活水平的提高，對(duì)肉品質(zhì)的需要也越來越高，近年來，國內(nèi)外市場(chǎng)上的肉制品摻假事件頻繁發(fā)生，這些不法行為不僅破壞了公平貿(mào)易，給消費(fèi)者帶來經(jīng)濟(jì)損失，更重要的是引起了宗教信仰、食品安全等方面的問題。

先達(dá)基因科技有限公司自主開發(fā)的核酸檢測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，可對(duì)各類肉源性成分核酸特異基因片段進(jìn)行擴(kuò)增及定性檢測(cè)，通過實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，在短時(shí)間內(nèi)判斷樣品中是否含有其肉源性成分。ERA技術(shù)在動(dòng)物源性檢測(cè)方面具有簡(jiǎn)單高效等優(yōu)點(diǎn)，為市售生鮮肉制品摻假提供了快速便捷的檢測(cè)方法。

 

3、轉(zhuǎn)基因檢測(cè) 

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，其在農(nóng)業(yè)技術(shù)方面的應(yīng)用也越來越廣泛，轉(zhuǎn)基因食品也走向市場(chǎng)， 在轉(zhuǎn)基因食品的監(jiān)測(cè)方面，監(jiān)管部門也面臨越來越大的壓力。

先達(dá)基因自主開發(fā)的核酸檢測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，可對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物PAT基因片段進(jìn)行擴(kuò)增及定性檢測(cè)，通過實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，在短時(shí)間內(nèi)判斷樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物PAT基因成分。該方法可在 15～25 min 可靠地檢測(cè)出樣品中的 100 個(gè)拷貝的目標(biāo)分子。這種新的擴(kuò)增方法大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化了反應(yīng)過程，為轉(zhuǎn)基因作物的快速檢測(cè)提供了一種快速有效的方法。

本產(chǎn)品可用于食品生產(chǎn)加工企業(yè)對(duì)產(chǎn)品中潛在的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物PAT基因進(jìn)行快速檢測(cè)與篩查；國家、地方食品藥品監(jiān)督管理單位對(duì)抽樣食品中潛在的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物NOS基因進(jìn)行快速檢測(cè)；重大活動(dòng)中的食品安全保障；食品安全突發(fā)事件中的快速檢測(cè)等。

這種現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法同樣適用于未經(jīng)訓(xùn)練的人員對(duì)樣品進(jìn)行快速簡(jiǎn)單的測(cè)試。ERA技術(shù)為轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)提供了快速便捷的方法。

 

04、結(jié)論 

ERA 恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)。這種反應(yīng)沒有熱循環(huán)的需要，可使用簡(jiǎn)單設(shè)備，如小型加熱器等，價(jià)格低廉，可以進(jìn)行最低限度的維護(hù)控制。具體來說，ERA 具有恒溫、較低溫度、擴(kuò)增時(shí)間短、可靠性和簡(jiǎn)單性等特點(diǎn)。核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定還具有靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全核酸檢測(cè)領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

它提供了一種能夠檢測(cè)潛在食物威脅因素的方法，如過摻假肉、轉(zhuǎn)基因生物或病原體。傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)由于耗時(shí)長，設(shè)備復(fù)雜，因此不利于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，已不能滿足食品安全檢測(cè)的更高需求，因此建立一種快速便攜、靈敏、特異的檢測(cè)方法十分重要。ERA 作為一個(gè)新興的分子檢測(cè)技術(shù)， 迄今為止，不僅在醫(yī)藥學(xué)等方面應(yīng)用較多，而且在食品安全檢測(cè)方面的研究也初有成效，隨著 ERA 技術(shù)不斷地應(yīng)用與研發(fā)，未來 ERA 將朝更加快速、便攜、敏感、特異的方向發(fā)展，給食品安全檢測(cè)的研究帶來新的方向。