細胞凍存與復蘇注意事項

細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。

在不加任何物質(zhì)的條件下，直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。若向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞。儲存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細胞凍存

細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的-5~0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油。

在細胞的凍存與復蘇過程中，有如下事項需要注意。

1、不要在細胞狀態(tài)不好時，進行細胞凍存。如，長的太過了，培養(yǎng)液已經(jīng)很黃了；細胞可疑污染；細胞已經(jīng)開始凋亡或崩解；連續(xù)培養(yǎng)超過二個月，細胞性狀已有改變。應該在增殖旺盛，情況穩(wěn)定，實驗效果良好，復蘇后兩周內(nèi)進行細胞凍存。

2、凍存時細胞濃度低于1-5×106個/ml，很難復蘇成功，應該離心后調(diào)整細胞濃度。

3、一定要選擇原配的管子和蓋子（不同牌子/型號的顏色會有差別），凍存管的蓋子一定要擰緊，否則復蘇水浴時會滲水，造成污染。

4、盡量選擇程序冷凍盒進行細胞凍存。如果沒有，應選擇厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。防止放在-80℃的凍存盒，壁太薄，細胞被迅速降溫。確保“緩降”。

5、凍存的細胞應盡快轉(zhuǎn)入液氮，不要在-80℃冰箱放置超過一個月。

6、防止找不到或拿錯細胞，每只凍存管都應標上細胞的名稱，凍存時間，并記錄在冊。

7、取細胞時應做好防護措施，帶好防凍手套，護目鏡。細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。

8、必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化，復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷。如果凍存管的壁較厚，隔熱效果較好，可以適當提高水浴溫度（37℃~40℃）。二甲亞砜（DMSO）最好選擇進口產(chǎn)品。

9、提前預定超凈臺，減少復蘇后插在冰盒里等待的時間。復蘇后長時間（1h），還沒有加入新的培養(yǎng)液。高濃度DMSO防止胞內(nèi)形成冰晶，凍存時保護細胞，但復蘇溶解后，浸泡時間太久會對細胞有毒性。

10、關(guān)于細胞溶解后，是否需要離心的問題，需要根據(jù)特定的細胞情況而定。主要有兩種方式。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，第二天換液（后貼壁后即換液）。因為離心的目的是兩個，去除DMSO，去除死細胞，這個是標準流程。但對一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時間，轉(zhuǎn)的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過了活細胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染。另一種是須離心后，將凍存液倒干凈，且一定要倒干凈。

11、對于不離心直接加入培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)基的加入量是個需要考慮的問題。主要涉及DMSO的濃度，如果你加入培養(yǎng)基太少，DMSO的濃度就會比較大，影響細胞生長。而加入培養(yǎng)基太多，又會影響細胞的貼壁效果。

12、DMSO的濃度在小于5%（也有說1%）的時候?qū)σ话慵毎麤]有什么影響。所以如果你的凍存液的濃度是10%DMSO，那么1ml的細胞加入10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。

13、有些細胞復蘇后一星期才有起色，切忌要有耐心，不要換液，耐心等待，兩周后再做決定。不要復蘇三四天后，細胞沒有任何動靜，認為失敗，倒掉所有細胞。