三種流式方法檢測細(xì)胞凋亡

一、檢測原理

細(xì)胞發(fā)生凋亡時，其細(xì)胞膜的通透性也增加，但其程度介于正常細(xì)胞和壞死細(xì)胞之間。利用這一特點，被檢測細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀測量細(xì)胞懸液中熒光強(qiáng)度來區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。

流式細(xì)胞儀檢測有下列特點

1、檢測的細(xì)胞數(shù)量大，因此其反映群體細(xì)胞的凋亡狀態(tài)比較準(zhǔn)確

2、可用許多相關(guān)分析

3、結(jié)合被測細(xì)胞DNA含量分析，可確定凋亡的細(xì)胞所處的細(xì)胞周期。但該法周樣也具有標(biāo)本制作復(fù)雜。非原位檢測，不易與變性細(xì)胞鑒別等因素的限制。

二、檢測方法

1、檢測形態(tài)學(xué)及細(xì)胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法

細(xì)胞發(fā)生凋亡時，其細(xì)胞膜的通透性也增加，但其程度介于正常細(xì)胞和壞死細(xì)胞之間，利用這一特點，被檢測細(xì)胞懸液用熒光素染色，采用流式細(xì)胞儀測量細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。

常用Hoechs-PI染色法，正常細(xì)胞對染料有拒染性，熒光著色很淺，凋亡細(xì)胞主要攝取hoechs-PI染料，呈現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)色熒光，而壞死細(xì)胞主要攝取碘化丙啶（PI）而呈紅色熒光。

2、DNA片段原位標(biāo)記

凋亡細(xì)胞DNA片段原位末端檢測技術(shù)是指在細(xì)胞（或組織）結(jié)構(gòu)保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標(biāo)記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，UDTP）和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidy1 transferase，TdT）相反應(yīng)與凋亡細(xì)胞裂解后3'的羥基（-OH）端相結(jié)合經(jīng)顯色反應(yīng)后檢測DNA裂解點的技術(shù)。

DNA片段原位標(biāo)記法有兩種

（1）原位缺口轉(zhuǎn)移（in situ nick-translation，ISNT）技術(shù)，該技術(shù)是1994年由Fehsel等提出，它是利用DNA多聚酶I將標(biāo)記的核苷酸接到斷裂的3'-OH端

（2）原位缺口末端原位標(biāo)記技術(shù)（in situ end labelling technique，ISEL），該技術(shù)即TUNEL法，于1993年由Wijsman等提出，它是利用TdT將標(biāo)記DUTP接到3'-OH端。研究證明，TUNEL的敏感性遠(yuǎn)高于尤其對早期凋亡的檢出TUNEL更為適用。其原因可能是凋亡發(fā)生時DNA大多是雙鏈同時斷裂而單鏈斷裂少見。ISNT是依賴DNA多聚酶I的單鏈修復(fù)反應(yīng)，故陽性率較低。細(xì)胞凋亡時DNA斷裂早于形態(tài)學(xué)改變及DNA含量減少。因此該法較前述各法具有更高的靈敏性，但環(huán)死細(xì)胞亦有DNA裂點形成。因此環(huán)死亦可呈TUNEL陽性反應(yīng)。

3、檢測細(xì)胞膜成分變化的Annexin V聯(lián)合PI法

愛必信Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(目前已有30篇引用文獻(xiàn))，具有較好的可靠性及穩(wěn)定性。

（1）檢測原理

在細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）遷移至細(xì)胞膜外側(cè)。磷脂酰結(jié)合蛋白V（Annexin V）是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它與PS具有高度的親合力。因此，Annexin V可以作為控針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的PS。故利用對PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標(biāo)記上熒光素，同時結(jié)合PI拒染法進(jìn)行凋亡細(xì)胞雙染后用流式細(xì)胞儀即可檢測凋亡細(xì)胞。

（2）結(jié)果判斷

正�；罴�(xì)胞Annexin V、PI均低染；凋亡細(xì)胞Annexin V高染、PI低染；壞死細(xì)胞Annexin V、PI均高染。

（3）應(yīng)用價值

細(xì)胞發(fā)生凋亡時，膜上PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此Annexin V聯(lián)合檢測早期細(xì)胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又Annexin V聯(lián)全PI染色法不需固定細(xì)胞，可避免PI染色法因固定造成的細(xì)胞碎片過多及TUNEL法固定造成的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯(lián)合法PI更省時，結(jié)果亦更為可靠，是目前較理想的檢測細(xì)胞凋亡的方法。