細(xì)胞培養(yǎng)—如何應(yīng)對(duì)細(xì)胞老化

細(xì)胞老化的概念

生物個(gè)體及其細(xì)胞需經(jīng)生長(zhǎng)、發(fā)育、老化及死亡等階段，老化是生命發(fā)展的必然，任何細(xì)胞從誕生之時(shí)起，老化過(guò)程就開(kāi)始了。老化的細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白和受體蛋白合成減少，攝取營(yíng)養(yǎng)和修復(fù)染色體損傷的能力均下降，表現(xiàn)為細(xì)胞和胞核變形，線粒體、高爾基體扭曲或呈囊泡狀，胞質(zhì)色素沉著，細(xì)胞體積縮小，由此導(dǎo)致器官重量減輕，間質(zhì)增生硬化，功能代謝降低，儲(chǔ)備功能不足。

遺傳程序?qū)W說(shuō)：

遺傳程序?qū)W說(shuō)（genetic programmed theory）：認(rèn)為細(xì)胞的老化是由遺傳因素決定的，最終的老化死亡是遺傳信息耗竭的結(jié)果。例如體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞經(jīng)過(guò)50次分裂后便自行停止分裂；同卵雙生子“同生共死”現(xiàn)象等，都支持此學(xué)說(shuō)。現(xiàn)已了解，控制細(xì)胞分裂次數(shù)的機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)染色體末端的端粒結(jié)構(gòu)有關(guān)。

細(xì)胞老化的基本特征

1.細(xì)胞老化最開(kāi)始的現(xiàn)象通常為細(xì)胞內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)空泡（可能是凋亡小體），也可能會(huì)出現(xiàn)黑點(diǎn)，大多沿細(xì)胞周邊排布，內(nèi)部中間也可能會(huì)顯現(xiàn)一些，但相對(duì)周邊為少。

2.老化以后的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)立體感慢慢消失，開(kāi)始成扁平狀，細(xì)胞與細(xì)胞之間的間隔減小或混在一起，細(xì)胞不再是梭形，而會(huì)成為各種不規(guī)則形狀。

3.細(xì)胞折光性變差，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞“變薄”，做轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞死亡率會(huì)較高。但培養(yǎng)液不會(huì)發(fā)生迅速變黃的現(xiàn)象，仍清亮。（但如果是細(xì)菌污染的話，一般會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液的迅速變黃，混濁，鏡下可見(jiàn)大量繁殖的細(xì)菌；若是支原體污染的話，細(xì)胞也會(huì)失去正常形態(tài)，會(huì)有細(xì)胞的死亡）。

4.細(xì)胞的貼壁性減弱，開(kāi)始有細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中。

5.老化的細(xì)胞，表面分泌物會(huì)增多，細(xì)胞表面的純凈度越來(lái)越低。

6.分裂的細(xì)胞數(shù)量明顯地減少同時(shí)細(xì)胞的增殖速度也會(huì)大大下降。

7.細(xì)胞開(kāi)始長(zhǎng)角分化。

細(xì)胞形態(tài)改變

雖然由于細(xì)胞周期的中斷和DNA復(fù)制的停止，老化細(xì)胞內(nèi)的DNA含量與正常細(xì)胞類(lèi)似，但RNA與蛋白質(zhì)豐度均比正常細(xì)胞要明顯升高。這是因?yàn)�，盡管細(xì)胞進(jìn)入老化階段后蛋白質(zhì)的整體合成速率降低，但是蛋白質(zhì)的降解體系受到更加明顯的抑制，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)堆積。但，由于不同組織來(lái)源的細(xì)胞，其形態(tài)本就各不相同，因此，目前還并無(wú)客觀的、統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)從細(xì)胞形態(tài)判斷并定義老化細(xì)胞。換句話說(shuō)，目前并不能直接根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)去判斷是否老化細(xì)胞。

無(wú)論是原代細(xì)胞或是細(xì)胞株，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞老化現(xiàn)象是存在且常見(jiàn)的，但卻容易被操作人員忽略，老化的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)的特征包括：細(xì)胞增殖變慢、細(xì)胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、細(xì)胞體積增大、細(xì)胞扁平、細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象。

細(xì)胞老化原因總結(jié)

1.細(xì)胞老化最開(kāi)始的現(xiàn)象通常為細(xì)胞內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)空泡（可能是凋亡小體），也可能會(huì)出現(xiàn)黑點(diǎn)，大多沿細(xì)胞周邊排布，內(nèi)部中間也可能會(huì)顯現(xiàn)一些，但相對(duì)周邊較少；

2.老化的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，胞膜起泡，皺縮等現(xiàn)象；

3.老化以后的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)立體感慢慢消失，開(kāi)始成扁平狀，細(xì)胞與細(xì)胞之間的間隔減小或混在一起，細(xì)胞不再是梭形，而會(huì)成為各種不規(guī)則形狀；

4.細(xì)胞折光性變差，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞“變薄”，做轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞死亡率會(huì)較高，但培養(yǎng)液不會(huì)發(fā)生迅速變黃的現(xiàn)象，仍清亮。（如果是細(xì)菌污染的話，一般會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液的迅速變黃，混濁，鏡下可見(jiàn)大量繁殖的細(xì)菌；若是支原體污染的話，細(xì)胞也會(huì)失去正常形態(tài)，會(huì)有細(xì)胞的死亡）；

5.細(xì)胞的貼壁性減弱，開(kāi)始有細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)液中；

6.老化的細(xì)胞表面分泌物會(huì)增多，細(xì)胞表面的純凈度越來(lái)越低；

7.分裂的細(xì)胞數(shù)量明顯的減少，同時(shí)細(xì)胞的增殖速度也會(huì)大大下降；

8.細(xì)胞開(kāi)始長(zhǎng)角分化。

半乳糖苷酶法染色的衰老細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)中如何預(yù)防老化

1.防止細(xì)胞老化最主要還是要做到勤觀察、勤換液、勤傳代、勤保種，特別是傳代，不能等細(xì)胞太密了之后傳，一般細(xì)胞建議長(zhǎng)到70％融合度傳代最好；

2.換培養(yǎng)液應(yīng)該根據(jù)自己細(xì)胞消耗培養(yǎng)基的情況來(lái)確定是否該換。如果感覺(jué)時(shí)間不好把握的話就多培養(yǎng)幾瓶細(xì)胞，在不同的時(shí)間換液，最后再來(lái)比較下，看什么時(shí)候換液好，得出自己的結(jié)論；

3.選擇正確的血清與培養(yǎng)基：細(xì)胞對(duì)血清特別敏感，直接影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。一定要選擇適合的血清不然就會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不協(xié)調(diào)而導(dǎo)致細(xì)胞老化；

4.在間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)必然要進(jìn)行消化，但是消化對(duì)細(xì)胞的表面蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的破壞作用，因此不能長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行消化并且在選擇消化酶時(shí)也要選擇較為合適的pH和濃度，不然就會(huì)使細(xì)胞老化或者分化；

5.在開(kāi)始養(yǎng)細(xì)胞并傳代時(shí)，也要特別注意凍存細(xì)胞，以保持細(xì)胞有種子庫(kù)存在，可以有效避免細(xì)胞損傷。

雖然，老化細(xì)胞不會(huì)立即死亡，但其基因表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，如果細(xì)胞老化現(xiàn)象嚴(yán)重，建議從種子庫(kù)或工作庫(kù)重新復(fù)蘇細(xì)胞。