細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)要操作流程

實(shí)驗(yàn)材料：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基                          
血清（常規(guī)為FBS/NBS）                           
無(wú)菌PBS磷酸鹽緩沖液                
電動(dòng)移液槍
移液槍                              
超凈工作臺(tái)                             
無(wú)菌二甲基亞砜（DMSO）
針式濾器 (0.22μm PES膜) [NEST]
杯式濾器(0.22μm PES膜) [NEST]
15mL、50mL無(wú)菌離心管[NEST]
程序降溫盒[NEST]
PET/PETG方形試劑瓶[NEST]
移液管[NEST]
自動(dòng)旋蓋機(jī)[NEST]
盒裝無(wú)菌吸頭[NEST]
 
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

凍存液準(zhǔn)備：
一般的細(xì)胞：55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%牛血清（FBS/NBS）+5%DMSO
重要的細(xì)胞：90%牛血清（FBS/NBS）+10%DMSO
凍存液配置完成后，15ml離心管分裝，4℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆�。若配置量較大，可分裝入50ml離心管，-20℃條件下冷凍儲(chǔ)存。（若牛血清內(nèi)存在析出沉淀物，采用0.22μm 濾膜過(guò)濾除菌）
使用前37℃水浴加熱
待凍存細(xì)胞：使細(xì)胞凍存前，選擇細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，凍存前12~24h換新鮮培養(yǎng)基維持細(xì)胞狀態(tài)。
實(shí)驗(yàn)流程：
. 觀察待凍存細(xì)胞密度，約為80%~90%。用移液槍吸出陳舊培養(yǎng)基，加入無(wú)菌PBS清洗細(xì)胞1-2次，去除培養(yǎng)環(huán)境中的殘留培養(yǎng)基。
​. 加入適量對(duì)應(yīng)胰酶或消化液，使胰酶沒(méi)過(guò)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱消化。顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間不再連接成片，此時(shí)加入完終止液終止消化。
​. 用吸頭輕輕吹打細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液1000rpm，離心3-5min。丟棄上清，加入適量預(yù)先配制好的凍存液，輕輕吹打使細(xì)胞均勻并計(jì)數(shù)。用凍存液調(diào)節(jié)的細(xì)胞密度，使之終密度為5×106/ml～1×107/ml。
​. 用移液槍按照預(yù)計(jì)容量，分裝入細(xì)胞凍存管[NEST]中，采用自動(dòng)旋蓋機(jī)[NEST]旋蓋密封。
​. 標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾蕸r處-1℃～-2℃/ min，可將待凍存細(xì)胞按照以下步驟逐步凍存：室溫→4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（過(guò)夜）→液氮長(zhǎng)期保存。
​. 也可將待凍存放入程序降溫盒[NEST]，直接-80℃過(guò)夜，再轉(zhuǎn)移至液氮保存。

使用到的NEST產(chǎn)品：

無(wú)菌二甲基亞砜（DMSO）
針式濾器 (0.22μm PES膜) [NEST]
杯式濾器(0.22μm PES膜) [NEST]
15mL、50mL無(wú)菌離心管[NEST]
程序降溫盒[NEST]
PET/PETG方形試劑瓶[NEST]
移液管[NEST]
自動(dòng)旋蓋機(jī)[NEST]
盒裝無(wú)菌吸頭[NEST]