流式細胞術原理與應用盤點

流式細胞術（Flow cytometry，簡稱FCM）是一種基于流式細胞儀通過檢測偶聯(lián)熒光信號快速、準確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細胞或者顆粒）的多項特性技術，同時可以對特定群體進行分選。早期流式細胞術主要用于定性，后續(xù)慢慢發(fā)展為多參數(shù)定性、定量以及分選的技術。

研究對象：

顆粒性物質(zhì)，如大量的臨床樣本、外周血、骨髓、細胞穿刺液、洗脫液以及各種培養(yǎng)細胞、藻類、原生動物、病毒等生物性顆粒及人工合成微球等物理顆粒。

研究目的：

通過流式分析研究顆粒性物質(zhì)的特性，包括多種物理及生物學特征；通過利用不同熒光素標記不同組分將目的細胞與非目的細胞區(qū)分開來，從而獲得純度更高的目的細胞群并研究其物理及生物學特性。

技術特點：

1.檢測速度快；

2.準確性好；

3.精確度高；

4.細胞不被破壞；

5.靈敏度高；

6.可進行多參數(shù)檢測；

7.不單限于表面抗原，可根據(jù)發(fā)光度（如細胞體積）或熒光散射度（如DNA、RNA或蛋白含量、酶活性、特異抗原）來分離細胞。

流式細胞術的發(fā)展

流式細胞術是20世紀60年代后期開始發(fā)展起來的，流式細胞儀通過接受激光照射液流入細胞后的散射光信號和熒光信號反應細胞的物理化學特征，如細胞大小、顆粒度和抗原分子的表達情況等。主要應用于生命科學的基礎研究，尤其是免疫學、細胞生物學和分子生物學。80年代后期開始應用于臨床，輔助多種疾病的診斷，尤其是白血病的診斷和分型。隨后，利用流式分選干細胞過繼回輸用于疾病治療，如NK細胞回輸提高免疫力，CIK治療等。

隨著流式細胞術的發(fā)展，出現(xiàn)了多種型號的流式分析儀、分選儀，同時隨著配備的激光器的不斷升級，有些流式分析儀可進行多達10色以上的熒光分析。流式分析軟件的不斷優(yōu)化，使得流式結(jié)果分析變得更加快速、便捷，并能簡單獲得多形式的流式分析示圖，極大地豐富了生物學檢測分析應用領域。這一集多個學科的智慧于一身，將計算機、電子工程、光學、流體力學、數(shù)學及有機化學等多學科巧妙地融合起來而誕生的流式細胞術在免疫學、發(fā)育生物學、細胞動力學、生理學、細胞生物學、分子生物學等生物學及醫(yī)學研究的各個領域得到了廣泛的應用，具有重大應用價值。

流式細胞術的3大要素：

01流式細胞儀

盡管市面上有不同品牌的流式細胞儀，例如BD,Beckman coulter,Partec,Miltenyi,Agilent,Thermo等等，但其主要構(gòu)成不外乎液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、監(jiān)測分析系統(tǒng)。

（1）液流系統(tǒng)

（2）光路系統(tǒng)

光路系統(tǒng)即我們常說的激光器，根據(jù)其發(fā)射激光波長來分，如常見488nm藍激光器、635nm的紅激光器和405nm的紫激光器，由激光器發(fā)出的激光照射到細胞后其產(chǎn)生的光信號會經(jīng)過不同的光路系統(tǒng)被不同的通道接收。這些光信號包括散射光和熒光信號，F(xiàn)SC（散射光信號，用于量化反應細胞的大�。�、SSC（側(cè)向散射光，用于量化反應細胞的復雜程度），這些熒光信號來源于細胞上偶聯(lián)的熒光素，被激光激發(fā)后，會發(fā)射熒光信號。

（3）檢測分析系統(tǒng)

流式細胞儀的檢測分析系統(tǒng)就是以通道為單位將細胞的各個通道的光信號匯總分析，最終歸類樣本群體中的細胞物理化學特征。

通道，即光電倍增管，其主要作用為：將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娮有盘�；放大電子信號；分為散射光通道（FSC通道、SSC通道）以及熒光通道。一個激光器可以有多個熒光通道，一個通道可以對應多個熒光染料。

02樣品細胞

流式細胞術檢測對象包括細胞和組織，但是無論細胞或者組織，最終制備上樣的樣品均需要為單細胞懸液。這是由于細胞或者組織團塊以及碎片容易堵塞進樣管。

03熒光偶聯(lián)抗體

由于樣本細胞表達強弱是根據(jù)標記在其表面的熒光素被激光照射后激發(fā)出的熒光信號強弱來判斷的，所以樣本細胞必須標記偶聯(lián)熒光素抗體。

常見的流式細胞術應用

1.細胞群比例測定以及表型測定

運用流式細胞術測定某細胞群體或者細胞亞群的比例是其最基本功能。要完成細胞群比例測定我們需要明確：要測定的總體是什么，例如免疫細胞的特征表型是CD45,T細胞的特征表型是CD3，由此我們可以得到一群CD45+CD3+或者CD45+CD3-細胞，同理我們也可以對得到的這群細胞進行進一步劃分，最終得到我們的目標細胞群比例測定或者是表型測定。

2.細胞表面分子、胞內(nèi)抗原的檢測與分析

選擇與熒光素偶聯(lián)的抗體或使用一抗和與熒光素偶聯(lián)的二抗，通過抗原抗體結(jié)合原理，實現(xiàn)檢測細胞表面分子、胞內(nèi)抗原表達量的目的，并可以作為一種抗體開發(fā)質(zhì)控檢測手段。

3.細胞DNA倍體與周期檢測與分析

細胞周期（cell cycle）是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段，是細胞從2倍體到4倍體再分裂成2倍體的過程。

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一種核酸染料。可以與DNA結(jié)合，其熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量。因此，通過流式細胞儀PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區(qū)分為G1/G0，S和G2/M三期，從而可通過流式直方圖對各時相細胞百分率進行分析。

4.細胞凋亡的檢測與分析Annexinv/PI雙染法

細胞凋亡（Apoptosis）是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。通過流式細胞術分析，可快速準確的得到細胞處于早期、晚期凋亡的細胞比例，反映藥物處理對細胞狀態(tài)的影響。

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V進行熒光素（EGFP、FITC）標記，以標記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來

Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此區(qū)域的細胞為壞死細胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細胞在其中，甚至機械損傷的細胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，實驗結(jié)果越不可信，建議實驗中盡量控制這一象限細胞比例。

Q2:(AnnexinV+染料)+/PI+，此區(qū)域的細胞為晚期凋亡細胞。

Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此區(qū)域的細胞為早期凋亡細胞。

Q4：(AnnexinV-染料)-/PI--，此區(qū)域的細胞為活細胞。

5

流式分選術應用的運用解決了細胞學研究中一個很重要的課題分離純化，尤其是需要研究細胞功能時，如收集細胞培養(yǎng)上清通過ELISA檢測細胞分泌的細胞因子，細胞共培養(yǎng)檢測細胞的功能等，都需要得到高純度的細胞。

多重熒光標記的流式細胞分選技術檢測小鼠肌衛(wèi)星細胞數(shù)量流式細胞術展望

流式細胞術以其速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點，在學術研究、臨床治療等方面具有廣泛應用前景，并獲得越來越多的學術研究者及醫(yī)藥工作者的青睞。流式細胞儀也隨科技的進步向小型化、微型化、多重熒光分析方向發(fā)展，分析靈敏度和準確性也明顯提高。隨著生物醫(yī)藥的發(fā)展，流式細胞術的應用幾乎涵蓋了整個生命科學和醫(yī)學領域，將來也必然在學術研究、臨床免疫學、臨床血液腫瘤學、臨床微生物學應用、細胞分選等方面得到更廣泛的應用。