Xenium原位分析技術(shù)助力發(fā)現(xiàn)罕見的癌癥生物學(xué)特征
在您試圖了解腫瘤侵襲性的差異時(shí)，很容易錯(cuò)過那些隱藏在復(fù)雜腫瘤微環(huán)境中的微小異質(zhì)性，比如上圖乳腺癌樣本中的一小塊三陽性區(qū)域。在這篇文章中，我們將講述Xenium原位分析技術(shù)如何發(fā)現(xiàn)這種被其他方法遺漏的獨(dú)特的癌癥生物學(xué)特征。
兩個(gè)看似相同的腫瘤
一個(gè)腫瘤是非侵襲性的，相對(duì)無害
另一個(gè)卻逐漸形成侵襲性，變成有害的侵襲性腫瘤
為什么？
答案很簡(jiǎn)單：異質(zhì)性，但異質(zhì)性本身卻并不簡(jiǎn)單...
盡管癌癥是最臭名昭著的例子，但患者之間和患者自身的異質(zhì)性是所有疾病面臨的難題。事實(shí)上，即使在健康狀態(tài)下，絕大多數(shù)的人類生物學(xué)功能的正常行使也需要細(xì)胞異質(zhì)性。
細(xì)胞異質(zhì)性的評(píng)估因幾方面的挑戰(zhàn)而變得復(fù)雜。首先，小的分子波動(dòng)可能導(dǎo)致大的功能變化(1)。其次，基因組水平的異質(zhì)性可能不會(huì)轉(zhuǎn)化到轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組或結(jié)構(gòu)水平，反之亦然(2)。此外，空間背景會(huì)大大影響異質(zhì)性。
異質(zhì)性很難用傳統(tǒng)方法來解析，但在將單細(xì)胞數(shù)據(jù)的強(qiáng)大分辨率與空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提供的形態(tài)學(xué)背景相整合后，研究人員在捕捉這種復(fù)雜生物學(xué)現(xiàn)象的驅(qū)動(dòng)因素方面取得了很大進(jìn)展。這種方法計(jì)算量大，仍然依賴于推斷而不是直接觀察。盡管這些整體轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)科學(xué)探索很有幫助，但仍需要深入研究這些方法所發(fā)現(xiàn)的感興趣基因，才能真正了解其意義。
那么，如果有一種方法能夠?qū)渭?xì)胞分辨率的力量與空間基因表達(dá)的形態(tài)學(xué)背景融合到單個(gè)實(shí)驗(yàn)中，又會(huì)怎么樣？
想象一下，您是一名研究人員，上圖這份導(dǎo)管原位癌（DCIS）樣本正出現(xiàn)在您的工作臺(tái)上，并有機(jī)會(huì)采用Xenium原位分析。您會(huì)在分析中發(fā)現(xiàn)什么？
根據(jù)H&E染色后的傳統(tǒng)組織病理學(xué)評(píng)估，這份乳腺腫塊粗針穿刺活檢樣本被注釋為HER2+/ER+/PR- (4)。也就是說，這份樣本表達(dá)人類表皮生長因子受體2（HER2/ERBB2）和雌激素受體（ER/ESR1），但不表達(dá)孕酮受體（PR/PGR）。
為了生成亞細(xì)胞分辨率的基因表達(dá)圖譜，我們采用高度特異且靈敏的可環(huán)化鎖式探針來檢測(cè)感興趣的RNA轉(zhuǎn)錄本。這個(gè)樣本經(jīng)過10x Genomics公司Xenium人類乳腺基因表達(dá)panel（包含313個(gè)基因的探針）處理，反映了以往在單細(xì)胞圖譜數(shù)據(jù)中描述的致瘤和健康人類乳腺組織的狀態(tài)(5-7)。
根據(jù)H&E染色后的傳統(tǒng)組織病理學(xué)評(píng)估，這份乳腺腫塊粗針穿刺活檢樣本被注釋為HER2+/ER+/PR- (4)。也就是說，這份樣本表達(dá)人類表皮生長因子受體2（HER2/ERBB2）和雌激素受體（ER/ESR1），但不表達(dá)孕酮受體（PR/PGR）。
為了生成亞細(xì)胞分辨率的基因表達(dá)圖譜，我們采用高度特異且靈敏的可環(huán)化鎖式探針來檢測(cè)感興趣的RNA轉(zhuǎn)錄本。這個(gè)樣本經(jīng)過10x Genomics公司Xenium人類乳腺基因表達(dá)panel（包含313個(gè)基因的探針）處理，反映了以往在單細(xì)胞圖譜數(shù)據(jù)中描述的致瘤和健康人類乳腺組織的狀態(tài)(5-7)。
回顧圖2A所示的Xenium空間結(jié)果中的ESR1、ERBB2和PGR表達(dá)，發(fā)現(xiàn)所分析的組織切片的大部分區(qū)域同時(shí)表達(dá)ERBB2和ESR1轉(zhuǎn)錄本（HER2/ER雙陽性），或只表達(dá)ERBB2轉(zhuǎn)錄本（HER2陽性）。
然而，Xenium也發(fā)現(xiàn)了一小塊區(qū)域，大約5.5 mm x 7.5 mm，呈現(xiàn)出ERBB2、ESR1和PGR轉(zhuǎn)錄本的三陽性表達(dá)（HER2+/ER+/PR+；圖2A-D）�？紤]到受體狀態(tài)可用來預(yù)測(cè)患者預(yù)后和選擇治療策略(8-9)，鑒定這個(gè)獨(dú)特的三陽性區(qū)域的能力有多重要，相信已經(jīng)不言而喻。
為了全面研究組織生物學(xué)，Xenium原位分析將強(qiáng)大的單分子RNA測(cè)序與空間解碼技術(shù)相結(jié)合，能夠以亞細(xì)胞分辨率快速檢測(cè)整張組織切片中的數(shù)百個(gè)至數(shù)千個(gè)RNA靶點(diǎn)。這種類型的分析不僅能在生物學(xué)背景下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定位和分型，還能解決細(xì)胞間通訊的問題，分析細(xì)胞微環(huán)境并鑒定罕見的細(xì)胞浸潤。
Xenium通過獨(dú)特的四因素認(rèn)證化學(xué)方法，帶來了高特異性。每個(gè)靶點(diǎn)都是利用掛鎖式探針鑒定的。
然而，Xenium也發(fā)現(xiàn)了一小塊區(qū)域，大約5.5 mm x 7.5 mm，呈現(xiàn)出ERBB2、ESR1和PGR轉(zhuǎn)錄本的三陽性表達(dá)（HER2+/ER+/PR+；圖2A-D）�？紤]到受體狀態(tài)可用來預(yù)測(cè)患者預(yù)后和選擇治療策略(8-9)，鑒定這個(gè)獨(dú)特的三陽性區(qū)域的能力有多重要，相信已經(jīng)不言而喻。
為了全面研究組織生物學(xué)，Xenium原位分析將強(qiáng)大的單分子RNA測(cè)序與空間解碼技術(shù)相結(jié)合，能夠以亞細(xì)胞分辨率快速檢測(cè)整張組織切片中的數(shù)百個(gè)至數(shù)千個(gè)RNA靶點(diǎn)。這種類型的分析不僅能在生物學(xué)背景下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定位和分型，還能解決細(xì)胞間通訊的問題，分析細(xì)胞微環(huán)境并鑒定罕見的細(xì)胞浸潤。
Xenium通過獨(dú)特的四因素認(rèn)證化學(xué)方法，帶來了高特異性。每個(gè)靶點(diǎn)都是利用掛鎖式探針鑒定的。
兩條臂與靶點(diǎn)穩(wěn)定雜交（第1步和第2步）
探針末端彼此連接，形成一個(gè)環(huán)狀探針（第3步）
成功完成這個(gè)環(huán)狀探針的滾環(huán)擴(kuò)增（第4步）
這種方法的靈敏度很高，足以區(qū)分高同源性的RNA，并檢測(cè)低表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。Xenium高靈敏度的化學(xué)方法與亞細(xì)胞空間分辨率的組合對(duì)于這種三陽性區(qū)域的檢測(cè)至關(guān)重要。
在檢測(cè)過程中，熒光標(biāo)記的探針自動(dòng)進(jìn)入循環(huán)、孵育、成像，并被儀器去除。在儀器運(yùn)行結(jié)束后，數(shù)據(jù)即被整合，建立起整張組織切片的轉(zhuǎn)錄本空間圖譜。
Xenium對(duì)整張組織切片的高分辨率分析是促成這個(gè)（三陽性）區(qū)域被鑒定出的另一個(gè)重要因素。在此次分析中，三陽性區(qū)域大約只有0.1 mm2，而總面積為42 mm2。這個(gè)稀疏的區(qū)域?qū)Ψ前邢蚧虻头直媛史椒▉碚f是一大挑戰(zhàn)。此外，由于一些空間技術(shù)只能對(duì)實(shí)驗(yàn)前預(yù)先選擇的感興趣區(qū)域進(jìn)行分析，那么這個(gè)小區(qū)域就很容易被忽略，因?yàn)橐酝鶝]有辦法知道它包含獨(dú)特的生物學(xué)特征。
對(duì)這張切片的詳細(xì)分析揭示出三個(gè)不同的腫瘤亞型，其細(xì)胞微環(huán)境有著顯著差異（圖3）。對(duì)于整張切片的高度異質(zhì)性活檢，Xenium能夠提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，表明它有能力應(yīng)對(duì)富有挑戰(zhàn)性的組織類型。
Xenium原位分析的另一個(gè)強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)在于它能夠在Xenium運(yùn)行后對(duì)同一組織切片進(jìn)行免疫熒光染色（圖4）。這種功能之所以能夠?qū)崿F(xiàn)，是因?yàn)閮x器上非破壞性的生化和解碼循環(huán)保留了蛋白質(zhì)表位。盡管一些空間技術(shù)能夠提供RNA和蛋白表達(dá)的分析，但其中許多需要使用連續(xù)的載玻片來分析不同的分析物類型，這使得分析物無法同時(shí)實(shí)現(xiàn)大規(guī)�？梢暬�。在Xenium處理過程中，組織的完整性得以保留，這意味著在Xenium處理后也可以進(jìn)行H&E染色（圖2C）。獲得同一張組織切片的組織病理學(xué)、蛋白表達(dá)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，可幫助您更全面地了解樣本的生物學(xué)特征。
在探究腫瘤是否會(huì)繼續(xù)保持良性還是轉(zhuǎn)變成侵襲性這樣的復(fù)雜生物學(xué)問題時(shí)，大海撈針有時(shí)似乎比破譯癌癥背后的分子機(jī)制要簡(jiǎn)單一些。然而，每一個(gè)新的生物學(xué)機(jī)制都有可能改變我們?cè)\斷和治療癌癥的方式，甚至在某一天還能治愈癌癥。
參考資料：
Xenium對(duì)整張組織切片的高分辨率分析是促成這個(gè)（三陽性）區(qū)域被鑒定出的另一個(gè)重要因素。在此次分析中，三陽性區(qū)域大約只有0.1 mm2，而總面積為42 mm2。這個(gè)稀疏的區(qū)域?qū)Ψ前邢蚧虻头直媛史椒▉碚f是一大挑戰(zhàn)。此外，由于一些空間技術(shù)只能對(duì)實(shí)驗(yàn)前預(yù)先選擇的感興趣區(qū)域進(jìn)行分析，那么這個(gè)小區(qū)域就很容易被忽略，因?yàn)橐酝鶝]有辦法知道它包含獨(dú)特的生物學(xué)特征。
對(duì)這張切片的詳細(xì)分析揭示出三個(gè)不同的腫瘤亞型，其細(xì)胞微環(huán)境有著顯著差異（圖3）。對(duì)于整張切片的高度異質(zhì)性活檢，Xenium能夠提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，表明它有能力應(yīng)對(duì)富有挑戰(zhàn)性的組織類型。
Xenium原位分析的另一個(gè)強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)在于它能夠在Xenium運(yùn)行后對(duì)同一組織切片進(jìn)行免疫熒光染色（圖4）。這種功能之所以能夠?qū)崿F(xiàn)，是因?yàn)閮x器上非破壞性的生化和解碼循環(huán)保留了蛋白質(zhì)表位。盡管一些空間技術(shù)能夠提供RNA和蛋白表達(dá)的分析，但其中許多需要使用連續(xù)的載玻片來分析不同的分析物類型，這使得分析物無法同時(shí)實(shí)現(xiàn)大規(guī)�？梢暬�。在Xenium處理過程中，組織的完整性得以保留，這意味著在Xenium處理后也可以進(jìn)行H&E染色（圖2C）。獲得同一張組織切片的組織病理學(xué)、蛋白表達(dá)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，可幫助您更全面地了解樣本的生物學(xué)特征。
在探究腫瘤是否會(huì)繼續(xù)保持良性還是轉(zhuǎn)變成侵襲性這樣的復(fù)雜生物學(xué)問題時(shí)，大海撈針有時(shí)似乎比破譯癌癥背后的分子機(jī)制要簡(jiǎn)單一些。然而，每一個(gè)新的生物學(xué)機(jī)制都有可能改變我們?cè)\斷和治療癌癥的方式，甚至在某一天還能治愈癌癥。
參考資料：
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- Pal B, et al. A single-cell RNA expression atlas of normal, preneoplastic and tumorigenic states in the human breast. The EMBO Journal. 40: e107333 (2021). doi: 10.15252/embj.2020107333
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- Dunnwald LK, Rossing MA & Li CI. Hormone receptor status, tumor characteristics, and prognosis: a prospective cohort of breast cancer patients. Breast Cancer Res 9: R6 (2007). doi: 10.1186/bcr1639
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