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1. 引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產(chǎn)，而Bioneer自行研制的專利384并行高通量DNA合成儀，可實(shí)現(xiàn)99%的高合成率。無論采用什么機(jī)器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個(gè)循環(huán)用時(shí)的多少。

亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。

第一步是將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5′-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5′-羥基。

第二步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5′-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。

第三步，帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5′-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉。

第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦�穩(wěn)定的磷酸三酯。

經(jīng)過以上四個(gè)步驟，一個(gè)脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5′-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。

通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮、脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測(cè)定OD260定量，根據(jù)定單要求分裝。

2.引物純化方式有哪些，如何選擇？

◆ 脫鹽

寡核苷酸合成后，為了純化寡核苷酸成為天然的DNA結(jié)構(gòu)，首先必須去除保護(hù)基團(tuán)。通過濃氨水處理，合成的寡核苷酸從固相載體上分離，2-氰乙氧基--磷酸二脂鍵的保護(hù)基團(tuán)，以及堿基的保護(hù)基團(tuán)基（苯甲�；�和異丁基）被去除，從而形成了天然的DNA結(jié)構(gòu)。然而，必要的去保護(hù)步驟完成后，寡核苷酸混合物還包含幾種必須被去除的小分子有機(jī)化合物。所有非必須有機(jī)化合物被移除的過程通常叫做脫鹽。脫鹽純化可以借助反向硅膠柱進(jìn)行。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必須有機(jī)雜質(zhì)，但它不能有效移除合成中產(chǎn)生微量的提前終止的寡核苷酸雜鏈。然而，脫鹽的寡核苷酸還是能夠滿足ＰＣＲ檢測(cè)等基礎(chǔ)生物研究。

◆ BioRP / OPC純化

如果寡核苷酸以“三苯甲基”的形式合成，則N-甲基寡核苷酸包含5’-DMT基團(tuán)，提前終止的寡核苷酸不包含該基團(tuán)。因?yàn)镈MT基有強(qiáng)的親脂的特性，有5’-DMT基團(tuán)的寡核苷酸與反相樹脂有親和性，因此反相親和樹脂通常被用于寡核苷酸的純化。利用反向樹脂和5’－DMT寡核苷酸存在強(qiáng)親和力，但是提前終止的寡核苷酸不包含DMT基團(tuán)，所以，我們能夠成功的把想要的N-甲基寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質(zhì)中分離出來。

◆ HPLC

如果合成的寡核苷酸應(yīng)用于克隆，定向誘變或定量的基因探測(cè)，那么對(duì)其純度要求較高。脫鹽或OPC純化的寡核苷酸可能達(dá)不到要求，則HPLC純化被廣泛地用于這個(gè)目的。作為一種純化樹脂，陰離子交換樹脂或反向樹脂被用于寡核苷酸純化。陰離子交換樹脂的HPLC通常顯示95-98%純化效率，對(duì)于達(dá)到35-mer寡核苷酸的純化是充分的。反向樹脂化的HPLC與陰離子交換樹脂的HPLC呈現(xiàn)相似的純化效率。因?yàn)镠PLC的純化效率很大程度依靠寡核苷酸的長(zhǎng)度，用HPLC法不能有效純化長(zhǎng)的寡核苷酸（大于35-mer)。

◆ PAGE

對(duì)于長(zhǎng)的寡核苷酸的純化（50-100mer），我們推薦PAGE純化法，它使用交連的聚丙烯酰胺凝膠(電泳)作為純化基質(zhì)。盡管PAGE顯示出高的純化效率（＞98%），但它在額外的步驟方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脫鹽，繼而將導(dǎo)致純化產(chǎn)率的下降。

3.引物的OD數(shù)如何定量？

答：引物合成引物OD數(shù)是這樣測(cè)定的：用紫外分光光度計(jì)，波長(zhǎng)260nm，石英比色杯，光程為1厘米，測(cè)定溶液的光密度。測(cè)定時(shí)溶液的光密度最好稀釋到0.2-1.0之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用1ml水稀釋測(cè)OD值。需要根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出母液的OD值。

4.需要什么級(jí)別的引物？

答：引物常用的純化方式脫鹽、BioRP / OPC純化、PAGE純化、HPLC純化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，確定訂購(gòu)引物的純度級(jí)別。
 
5.最長(zhǎng)可以合成多長(zhǎng)的引物？

答：引物越長(zhǎng)，出現(xiàn)問題的概率就越大。有的公司合成過120base的引物，產(chǎn)率很低。除非需要，建議合成片段長(zhǎng)度不要超過80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗產(chǎn)品，全長(zhǎng)（還不一定正確）引物的百分比不會(huì)超過40%，后續(xù)處理還有丟失很多，最后的產(chǎn)量很低。

6.需要合成多少OD數(shù)？

答：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定。一般PCR擴(kuò)增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構(gòu)建的引物都比較長(zhǎng)，但是我們有些研究人員也要求高OD數(shù)。片段越長(zhǎng), 最后全長(zhǎng)得率就越低，出錯(cuò)的幾率就越大。超出需要之外的OD數(shù)要求，其實(shí)也是對(duì)社會(huì)資源的一種浪費(fèi)，同時(shí)也從一個(gè)側(cè)面反映了部分研究人員特別是新手的自信心不足，總覺得需要重復(fù)多次才能成功。

7.如何檢測(cè)引物的純度？

答：實(shí)驗(yàn)室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后(約2-3小時(shí))，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測(cè)帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。

而有的廠家提供Maldi-TOF質(zhì)譜QC質(zhì)量控制，從而保障了合成的準(zhǔn)確率：

Bioneer使用多重Maldi-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行全自動(dòng)裝載及監(jiān)測(cè)。 每份樣品的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)將自動(dòng)插入到寡核苷酸的信息單中。Bioneer是世界上僅有的幾個(gè)對(duì)生產(chǎn)的每份核苷酸 (單個(gè)寡核苷酸和高通量和成) 都用MALDI-TOF質(zhì)譜儀檢測(cè)進(jìn)行核苷酸QC檢測(cè)的廠商，而且免費(fèi)提供質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

8.如何計(jì)算引物的濃度？

答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情況下，建議將引物的濃度配制成50pmol/ul，加水的體積（微升）按下列方式計(jì)算：V (微升)= OD數(shù)*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以從合成報(bào)告單上獲得。如果需要配制成其他濃度，按上述公式換算。

注意：1 OD260= 33 ug/ml.

9.如何計(jì)算引物的Tm值？

答：引物設(shè)計(jì)軟件都可以給出Tm，與引物長(zhǎng)度、堿基組成、引物使用緩沖的離子強(qiáng)度有關(guān)。

長(zhǎng)度為25mer以下的引物，Tm計(jì)算公式為：

Tm =            4℃   (G + C)+            2℃   (A + T)

對(duì)于更長(zhǎng)的寡聚核苷酸，Tm計(jì)算公式為：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size

公式中，Size = 引物長(zhǎng)度。

Tm的定義：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.

10.引物（含修飾）的分子量是如何確定的？

答：非修飾的引物的Molecular Weight在隨引物提供的報(bào)告單上都有明確的標(biāo)示。如果需要估計(jì)一個(gè)引物的分子量按每個(gè)堿基的平均分子量為324.5，引物的分子量=堿基數(shù) x 堿基的平均分子量�；虬聪铝泄�式計(jì)算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns- 62.

NA, NG, NC, NT, Ni分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數(shù)量，WA, WC, WG, W, Wi分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分別為修飾基團(tuán)的數(shù)目和分子量。

對(duì)于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數(shù)，例如G+A混合的分子量為（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns為硫代數(shù)目，硫代每個(gè)位置增加分子量16。
 
11.如何溶解引物？

答：干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開蓋前最好離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據(jù)計(jì)算出的體積加入去離子無菌水或            10mM Tris pH7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因?yàn)橛行┱麴s水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩(wěn)定。

12.如何保存引物？

答：引物合成后，經(jīng)過一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。引物在溶解前，室溫狀態(tài)下可以長(zhǎng)期保存。溶解后的引物-20度可以長(zhǎng)期保存。如果對(duì)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性要求較高，合成的OD數(shù)較大，建議分裝，避免反復(fù)凍融。修飾熒光引物需要避光保存。

13.合成的引物5'端是否有磷酸化

答：合成的引物            5'    為羥基，沒有磷酸基團(tuán)。如果需要您可以用多核苷酸激酶進(jìn)行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成時(shí)直接在5′或3′端進(jìn)行磷酸化，需要另外收費(fèi)。

14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？

連接反應(yīng)需要引物的            5’磷酸基團(tuán)。如果需要將合成的引物退火直接連接相應(yīng)的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產(chǎn)物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，退火的難度較大，退火時(shí)需要提高退火溫度。

15.測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物有突變是怎么回事？

答：測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是40個(gè)堿基以下的引物, 發(fā)生的概率不大，但是肯定也會(huì)發(fā)生。用戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列COPY到合成儀的，堿基輸錯(cuò)的機(jī)會(huì)不多。核酸合成公司一般會(huì)有一套控制辦法，預(yù)防堿基輸入錯(cuò)誤。發(fā)生這種突變的原因有很多解釋，人們還沒有辦法徹底解決這個(gè)問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機(jī)器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國(guó)公司提供的，所有每個(gè)合成服務(wù)商遇到的問題也基本類似，沒有人可以超脫。

引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng)，合成效率最高也就是99%，副產(chǎn)品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復(fù)，一般認(rèn)為，偶連過程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導(dǎo)致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認(rèn)為是一般認(rèn)為是帶帽(capping)反應(yīng)不徹底造成的，Caping反應(yīng)主要是封閉極少數(shù)5′-羥基沒有參加反應(yīng)單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時(shí)將不能繼續(xù)參與合成。對(duì)于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是堿基不能100%脫保護(hù)，即引物上可能含有殘留保護(hù)基團(tuán)，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補(bǔ)鏈配對(duì)，當(dāng)擴(kuò)增的產(chǎn)品被亞克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，可能被細(xì)菌中修復(fù)系統(tǒng)補(bǔ)上了非配對(duì)的堿基。置換突變通常發(fā)生在G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體 （脫嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA復(fù)制和擴(kuò)增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測(cè)序就會(huì)發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫嘌呤現(xiàn)象在富含嘌呤的引物中發(fā)生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護(hù)階段如果被降解，測(cè)序就會(huì)發(fā)現(xiàn)堿基G或A的缺失。

引物合成過程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發(fā)生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，還沒有能夠應(yīng)用到規(guī)�；�生產(chǎn)中。

16.長(zhǎng)鏈引物為什么出錯(cuò)的幾率非常高？

答：引物合成時(shí)，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到100%，產(chǎn)生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長(zhǎng)，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴(kuò)增，不可能絕對(duì)保證擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯(cuò)誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴(kuò)增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長(zhǎng)鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。

17.如果測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？

答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯(lián)系，生產(chǎn)人員會(huì)檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對(duì)合成序列是否和定單一致，他們?cè)陔娔X中一般會(huì)保留所有原始數(shù)據(jù)。在確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯(cuò)的情況下，建議重新挑取克隆測(cè)序，可能會(huì)找到正確克隆的。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，40個(gè)堿基以下的引物，測(cè)1-2個(gè)克隆就可以了；40個(gè)以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測(cè)一些了。一般情況下，每個(gè)克隆突變的位點(diǎn)都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費(fèi)重合一次，不過重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會(huì)因?yàn)橹睾系囊�物就減少您的遇到問題的幾率�；�因拼接過程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點(diǎn)不多，就多測(cè)幾個(gè)，否則就重合一下引物。

18.引物是經(jīng)過PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？

答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個(gè)堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時(shí)的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時(shí)，很難說不割到差別僅幾個(gè)堿基的引物。國(guó)內(nèi)有一個(gè)不好的現(xiàn)象，PAGE純化的引物，特別是長(zhǎng)引物要的量都比較高，導(dǎo)致割的條帶有時(shí)可能比較寬。建議：您如果減少OD數(shù)，引物遇到的問題可能就會(huì)少一些。

19. TaqMan 探針設(shè)計(jì)的基本原則是什么？

答：下列原則供您參考。
◆TaqMan 探針位置盡可能靠近擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物50-150bp），但不能與引物重疊。
◆長(zhǎng)度一般為18-40mer 。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。
◆在引物的5'端避免使用G。
◆選用比較多的堿基C。
◆退火溫度Tm控制在 68-            70C   左右。
 
20.Primer設(shè)計(jì)的基本原則是什么？

答：引物設(shè)計(jì)的下列原則供您參考。
◆引物長(zhǎng)度一般在18-35mer。
◆G-C含量控制在40-60%左右。
◆避免近          3'    端有酶切位點(diǎn)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
◆如果可能避免在          3'   端最后5個(gè)堿基有2個(gè)以上的G或C。
◆如果可能避免在            3'    端最后1個(gè)堿基為A。
◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。
◆退火溫度Tm控制在 58-            60C    左右。
◆如果是設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物，突變點(diǎn)應(yīng)盡可能在引物的中間。

21.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：引物應(yīng)該全是DNA，但是OD260/OD280的比值為什么那么低，怎么會(huì)有蛋白質(zhì)污染？引物化學(xué)合成，哪里有機(jī)會(huì)污染到蛋白質(zhì)？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個(gè)20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。