Nature解讀：Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)助力揭開mRNA識別和包裝之謎

真核生物的基因表達需要成熟的mRNA從細胞核選擇性轉運到細胞質(zhì)進行翻譯。新生成的mRNA被加工和包裝成核糖核蛋白復合物(mRNPs)后，通過必需轉錄輸出復合物(TREX)識別輸出。然而，mRNP識別和三維組織的機制尚不清楚。

近日，維也納生物中心分子病理學研究所在Nature (IF: 69.504)雜志上發(fā)表了名為mRNA recognition and packaging by the human transcription-export complex的研究。研究報道了重組和內(nèi)源性TREX – mRNA結構，并提出了核mRNA識別和包裝的機制。
 

1 冷凍電鏡分析
TREX通過其ALYREF亞基多價作用于mRNA結合的EJC（外顯子連接復合體）。為了解其相互作用機制，作者重組了一系列不同RNA長度(15或50個核苷酸) 的ALYREFN-EJC-RNA多聚體復合物。ALYREF截斷實驗顯示，ALYREF (55-182) (殘基55-182) 是ALYREF - EJC – RNA有效重構和多聚的必要條件。ALYREF (55-182)-EJC-RNA復合物的多聚合依賴于蛋白-蛋白接觸。作者隨后純化分析了此復合物六聚體的冷凍電鏡結構。
 

圖1b. ALYREF55-182–EJC–RNA復合體冷凍電鏡分析（俯視圖和側視圖）

ALYREF-EJC-RNA復合體結構
ALYREF (55-182)-EJC-RNA的每個原聚體提供一個EJC – EJC（圖1b左）和三個ALYREF - EJC接口（擴展圖2h），通過保守的ALYREF –EJC多價作用（擴展圖2i），連接成一個環(huán)。為維持這種結構，ALYREF WxHD(界面b) 或RRM結構域(界面c和d) 突變，防止體外ALYREF - EJC - RNA復合物的形成和多聚。
 

擴展圖2h. ALYREF - EJC接口：ALYREF WxHD(界面b) 及RRM結構域(界面c和d) ；i. ALYREF、EIF4A3和MAGOH中ALYREF - ejc界面殘基多序列比對

該結構中，一個ALYREF分子橋接三個EJC-RNA復合物。兩個EJC分別連接mRNA兩端，ALYREF結合后使兩個EJC靠近及mRNP壓實。此外，ALYREF結合域1、2（RBD1和RBD2）結構域中富含Arg - Gly的保守基元是體外結合RNA所必需的。

綜上，ALYREF-和EJC介導的mRNP識別和包裝可能依賴于多價蛋白和蛋白- mRNA的相互作用。

ALYREF 將 mRNP橋接到 THO–UAP56
冷凍電鏡結果顯示(擴展數(shù)據(jù)圖2h)，只有ALYREF WxHD和RRM區(qū)域接觸EJC-RNA復合物。因此，ALYREF將EJC-RNA復合物與THO - UAP56的橋接，可能是通過其保守的多拷貝UAP56結合基(UBMs)實現(xiàn)。ALYREF-RNA結合活性包含在RBD1和RBD2結構域中。RNA過濾結合親和力試驗表明，RBD1和RBD2可能有助于RNA傳遞到UAP56，但對其與ALYREF55-182的結合無效。實驗采用Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)檢測RNA的標記熒光信號（488nm，Azure Biosystems），GraphPad Prism函數(shù)擬合計算親和力。

核提取物和體外生化數(shù)據(jù)支持這一模型。數(shù)據(jù)表明，ALYREF和THO的多價相互作用可能對TREX在mRNPs上的組裝以及UAP56向mRNA的有效遞送很重要。

進一步結構分析顯示，只有結合了mRNA的EJC才能形成多價ALYREF-EJC復合物，這表明mRNA前剪接可能先于mRNP包裝。

2 TREX-mRNP結構與接觸

TREX-mRNP多價模型
作者隨后對TREX-mRNP進行體外交聯(lián)及冷凍電鏡分析，與其天然配合物對比顯示：體外重建的ALYREF - EJC相互作用也發(fā)生在天然配合物中。此外，本研究確定了CBC內(nèi)以及EJC EIF4A3亞基與PSAP復合物亞基PININ之間的交聯(lián)，可與各種輸出適配器協(xié)同作用，并導致多價TREX-mRNP組裝。

TREX–mRNP 冷凍斷層掃描密度與冷凍電鏡結構非常吻合。

TREX復合物包被在mRNP表面
TREX復合物僅在mRNP表面結合，其四個UAP56亞基面向mRNP(圖4a, b)。但綜合分析表明，TREX復合物與mRNP相互獨立關聯(lián)，這可能是TREX適應mRNP形狀和大小多樣性所必需的。作者預測，2到3個TREX復合物可同時結合到平均含3500個mRNA核苷酸的人類mRNP上。
 

圖4a. 降噪后TREX - mRNP冷凍電鏡層析圖；b. 含有兩個TREX復合物的TREX - mRNPs圖

mRNP形成致密小球
mRNPs形成致密的球體，表面的TREX復合物發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，內(nèi)部蛋白（如SRSF家族蛋白）則發(fā)揮組織作用。

為比較研究TREX - mRNP結構中TREX及mRNP的環(huán)境親和力，作者建立了如下實驗：使用CRISPR-Cas9敲入系統(tǒng)，獲得GFP-THOC5及GFP-EIF4A3 的K562細胞系（THOC5為TREX亞基；EIF4A3為EJC亞基），將核提取物與攜帶熒光蛋白 AF647 的抗GFP納米體孵育。將混合物梯度超離心后，使用Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)進行成像（GFP和AF647熒光通道檢測），檢測納米體對不同GFP融合蛋白組分的親和力（重梯度組分為TREX-mRNPs GFP融合蛋白；輕梯度組分為游離的GFP-THOC5及GFP-EIF4A3蛋白）。結果顯示(擴展數(shù)據(jù)圖10b,c)，納米體與GFP-THOC5在所有組分都能很好地結合；相反，納米體在重梯度組分中與GFP-EIF4A3結合較差�？梢姡�TREX - mRNP結構中TREX的環(huán)境親和力強于mRNP。

此外，所有內(nèi)源性標記的GFP-THOC5或慢病毒過表達的THOC1-GFP核提取物，均可被抗GFP納米體免疫沉淀，而GFP-EIF4A3的反應效率則很低(擴展數(shù)據(jù)圖10e)。Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)檢測。這些數(shù)據(jù)均支持觀察到的TREX-mRNP結構。
 

擴展圖10a. 探測mRNP復合物中蛋白質(zhì)可及性的實驗示意圖；b. 核提取物GFP-THOC5在不同梯度組分中的SDS-PAGE熒光信號；c.核提取物GFP-EIF4A3在不同梯度組分中的SDS-PAGE熒光信號；e. Western blot顯示THOC1-GFP (異位過表達; Lenti O/E) ， GFP-THOC5(內(nèi)源性標記; endo) 及GFPEIF4A3(內(nèi)源性標記)的消耗速率（圖b,c,d,e為Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)拍攝）；f. GFP標記的THOC5或EIF4A3在TREX-mRNPs中可及性模型。

3 mRNA包裝和輸出模型
我們的研究結果提出了一個TREX依賴的核mRNA包裝和跨mRNA尺度輸出的模型(圖5)。
 

圖5. mRNA包裝模型

其中，TREX可能通過四種機制促進mRNA的生物發(fā)生：

一、TREX的包被在空間上限制mRNP。THO28、41和ALYREF53與UAP56的聯(lián)合多價結合可能共同刺激UAP56的ATP酶活性，調(diào)節(jié)隨后的mRNP重塑和mRNA輸出因子加載(圖5) 。二、在TREX-mRNP結構中，THO復合物位于mRNP表面，利于在核輸出之前從mRNP中釋放。三、核內(nèi)mRNA轉錄可避免有害的RNA-DNA相互作用或mRNP成熟過程中RNA-RNA接觸。反之，TREX缺陷導致DNA附近松散mRNA的積累，將造成基因組不穩(wěn)定。四、TREX包被可以解釋mRNPs如何免受核mRNA降解機制的影響。

成熟的mRNP具有與TREX類似的球狀結構，可更有效地通過擁擠的核質(zhì)和核孔復合物，mRNA輸出因子在其中被裝載到mRNP表面，使其通過核孔復合物的疏水屏障進行運輸。

4 總結與討論
核mRNP的識別包裝依賴于特異性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和非特異性蛋白質(zhì)- mRNA的相互作用，這可以解釋如何在不區(qū)分長度和序列不同的mRNA的情況下鑒定成熟的mRNA。mRNP獨特的球狀分子結構，對調(diào)節(jié)核mRNA的表達，維持核漿中mRNA的流動性，并促進mRNA核輸出具有重要意義。

原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-023-05904-0#Sec84

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